Técnica Para Inoculación

CEEA Técnicas de obtención e inoculación de muestras

A. Técnicas de obtención de muestras

1. A Extracción de sangre de vena mandibular

2. A Extracción de sangre de seno retro-orbital

3. A Biopsia de cola

4. A Marcaje en orejas

5. A Perfusión in vivo

B. Técnicas de inoculación de muestras

1. B Inoculación Subcutánea

2. B Inoculación Intraperitoneal

3. B Inoculación Intramuscular

4. B Inoculación Intradérmica

5. B Inoculación Intravenosa

6. B Inoculación en Almohadillas Plantares

Técnica nº1.A Extracción de sangre de Vena Mandibular

Anestesia: No requerida

Material: Aguja 19 – 21 G

Volumen de extracción: Consultar Tabla I

Descripción de la técnica:

1. Sujetar firmemente al ratón de manera que la cabeza quede alineada con el cuerpo, es decir, que no esté inclinada hacia el tórax o hacia los lados.

2. Comprimir ligeramente los vasos del cuello del lado opuesto al que se va a realizar la punción.

3. Localizar la pequeña zona circular desprovista de pelo situada centralmente en la mandíbula inferior (puede no estar presente en algunas cepas).

4. Con una aguja de 19-21 G, dependiendo de la edad y/o tamaño del ratón, realizar la punción (inclinando dorsalmente la aguja 1-2 mm) en la zona anteriormente descrita. La profundidad óptima es de 2-3 mm.

5. Recoger la sangre en el recipiente adecuado teniendo en cuenta que el flujo será de aproximadamente una gota (20l) por segundo.

6. Una vez obtenida la muestra liberar al ratón. El sangrado se detendrá automáticamente.

http://www.univ.trieste.it/~servpoli/stabpst.m1v

Técnica nº2.A Extracción de sangre de Seno Retro-orbital

Anestesia: Obligatoria

Material: Capilares tratados con anticoagulante (EDTA, heparina…)

Restricciones: Esta técnica debe ser llevada a cabo únicamente cuando no exista método alternativo y siempre por personal cualificado debido al elevado riesgo de dañar estructuras adyacentes al globo ocular, lo que puede originar infecciones severas, ceguera etc…

Volumen de extracción: Consultar Tabla I

Descripción de la técnica:

1. Una vez anestesiado el ratón y comprobado que se ha alcanzado el plano quirúrgico, sujetar al ratón estirando la piel del cuello hacia atrás asegurándose de no dificultar la respiración

2. Insertar el capilar en el ángulo externo del ojo (2 mm aprox) y girar suavemente hasta que la sangre fluya por el mismo.

3. Recoger la muestra y retirar el capilar.

4. Oprimir ligeramente la zona de punción con una gasa o papel para detener la hemorragia.

5. Aplicar pomada oftálmica (Lubrifilm) al ojo.

6. Comprobar que la recuperación de la anestesia se produce adecuadamente aportando las medidas que se consideren necesarias para ello (i.e , aporte de calor )

7. Observar al animal los días posteriores al sangrado para detectar la aparición de posibles complicaciones: protrusión de tejido adyacente al ojo, infecciones, hemorragias…

Fig. 1

Técnica nº 3. A Biopsia de cola

Anestesia: En función de la edad y sección de cola que se quiera obtener.

Material: Escalpelo, tijeras o cauterizador eléctrico.

Longitud máxima de la muestra: 5 mm

Requerimientos:

1. La longitud máxima a cortar es de 5 mm. De este fragmento se obtienen unos 50 g de DNA, suficiente para múltiples ensayos de genotipado. Muestras mayores a 5 mm requerirán autorización expresa del Comité Ético del centro.

2. La edad óptima para la realización de este procedimiento es de 15 a 21 días, antes de la calcificación de las últimas vértebras.

3. Requerimientos de anestesia:

- Ratones de menos de 28 días: anestesia no requerida.

- Ratones de más de 28 días: anestesia requerida para muestras de más de 2 mm

- Segunda biopsia: anestesia requerida independientemente de la longitud de la muestra a tomar.

4. Este procedimiento no debe ser desarrollado más de dos veces en el mismo ratón sin permiso del Comité Ético de Experimentación Animal.

Descripción de la técnica:

1. Inmovilizar al ratón en una mano o bien introducirlo en los “cepos” destinados a tal efecto.

2. Con las tijeras (previamente esterilizadas en llama), el escalpelo o “cortacolas” eléctrico, seccionar 2 mm de la cola.

3. Presionar la zona del corte con papel para detener la hemorragia.

4. No devolver al ratón a su jaula hasta comprobar que el sangrado se detiene

completamente.

Técnica nº4. A Marcaje por muescas en orejas

Anestesia: No requerida

Material: Marcador de orejas

Descripción de la técnica:

1. Inmovilizar al ratón con una mano de modo que las orejas queden perfectamente accesibles.

2. Proceder al marcado siguiendo el código de marcaje elegido. En nuestro caso, el código de marcas en las orejas es el siguiente:

- En la oreja derecha del ratón se marcan invariablemente las unidades, desde el 1 en la zona de la oreja más próxima al hocico, hasta el 4 en la parte más craneal de la misma. El 2 y 3 se marcan a ambos lados de la línea imaginaria que divide a la oreja en dos desde la zona más interna a la más externa; el 2 de la línea hacia abajo (hocico) y el 3 de la línea hacia arriba:

- Los números mayores de 4 se marcan según las combinaciones siguientes:

5 = 4 + 1

6 = 4 + 2

7 = 4 + 3

8 = 4 + 3 + 1

9 = 4 + 3 + 2

- Las decenas se marcan en la oreja izquierda del ratón siguiendo la misma disposición que las unidades, es decir, desde la zona de la oreja más próxima al hocico del animal (10) a la más craneal (40), siendo las combinaciones para formar el 50, 60, 70, 80, y 90 exactamente igual que las utilizadas para las unidades (50 = 40 + 10 etc)

Técnica nº 5. A Perfusión in vivo

Anestesia: Requerida. Ketamina / Xilacina (150mg/kg : 10mg/kg), Avertina, Pentobarbital etc…

Material: Solución de lavado (PBS 1x o Solución salina)

Solución de fijado (PFA 4%, Formaldehído 10%...)

Aparato de perfusión, jeringuillas o bomba peristáltica.

Agujas: 22G para ratón, 20G para rata.

Volúmenes: Solución de lavado: 10-25 ml (ratón) 50-100 ml (rata)

Solución de fijado: 50-100 ml (ratón) 400-600 ml (rata)

Restricción: Debido a la utilización de productos tóxicos como el formaldehído, este procedimiento deberá llevarse a cabo en una cabina de químicos.

Descripción de la técnica:

1. Una vez anestesiado el ratón y alcanzado el plano quirúrgico (ausencia de reflejo podal) colocarlo en posición decubito supino sobre una placa/rejilla adecuada para la recogida de los líquidos de lavado y fijación.

2. Estirar y sujetar las extremidades.

3. Lavar la superficie del ratón con etanol 70º

4. Realizar un corte en la piel a la altura del final del esternón, separar la piel y cortar las costillas en paralelo a los pulmones para exponer el corazón.

5. Insertar la aguja, bien de la jeringuilla o bien de la botella (en caso de utilizar el aparato de perfusión) que contiene la solución de lavado, en el ventrículo izquierdo y profundizar hasta alcanzar la aorta clampando la aguja a este nivel según se ve en el esquema siguiente:

En ratones puede ser muy difícil clampar la aorta por lo que la aguja deberá mantenerse sujeta mientras se realiza la perfusión.

6. Realizar una incisión en la aurícula derecha para permitir el escape de la circulación de retorno de los líquidos de lavado.

7. Proceder al lavado con la solución salina o PBS 1x. La velocidad de perfusión de los líquidos de lavado influirá en la correcta fijación de los órganos estimándose un tiempo mínimo de 10-20 min en ratón y 10 a 30 min en rata para los volúmenes anteriormente especificados. En el caso de utilizar el sistema de perfusión por gravedad, la altura a la que deben situarse las botellas con los líquidos de lavado y fijación es de 100 a 120 cm sobre el animal.

8. Proceder a la perfusión de la solución de fijado

9. Una vigorosa contracción muscular es indicativa de la correcta fijación del animal. En este momento retirar la aguja y proceder a la extracción de los órganos deseados.

Técnica nº 1. B Inoculación Subcutánea (SC o SQ)

Anestesia: No requerida

Material: Aguja 25G (ratón y rata)

Volumen máximo: 2-3 ml (ratón) 5-10 ml (rata)

Inoculaciones máximas: 2-3 inoculaciones por día

pH inoculación: Fisiológico (aprox. 7). Consultar Anexo 2.

Descripción de la técnica:

1. Depositar al ratón sobre la rejilla permitiéndole agarrarse a ella con las patas

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