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PRÁCTICA Nº 14

SEPARACIÓN DE COLORANTES POR CROMATOGRAFÍA CLÁSICA EN COLUMNA

Fundamento

En esta práctica se pretende visualizar las dos características fundamentales de todo proceso cromatográfico, como son la migración diferencial y el ensanchamiento de banda. Para ello procederemos a la separación mediante cromatografía líquida en columna de los componentes de una mezcla sencilla compuesta de dos colorantes, azul de metileno y anaranjado de metilo. Utilizaremos la modalidad de cromatografía de adsorción, empleando alúmina como adsorbente.

Dependiendo de la composición de la fase móvil así será mayor o menor la retención de los analitos. Recordemos que en cromatografía de adsorción las fases móviles más fuertes (mayor poder de elución) son las más polares, mientras que los disolventes apolares o poco polares son débiles (poco poder de elución). Así pues empleando etanol como fase móvil el azul de metileno es el único analito eluido mientras que el anaranjado de metilo es fuertemente retenido por la fase estacionaria. La elución de este último se lleva a cabo empleando una fase móvil fuerte como el agua.

El hecho de que los analitos sean coloreados nos va a permitir ver el ensanchamiento de la banda cromatográfica conforme desciende a lo largo de la columna.

Finalmente, iremos recogiendo fracciones correspondientes a la elución del azul de metileno y mediremos su absorbancia para después representarla frente al volumen de fase móvil. Obtendremos así el cromatograma con el pico del analito.

Reactivos y disoluciones necesarias

- Alúmina activada para uso en cromatografía.

- Para la fase móvil:

• Etanol.

• Agua destilada.

- Disolución problema: Disolución de azul de metileno y anaranjado de metilo en etanol conteniendo aproximadamente 0.05 g/l de colorante.

Material e instrumentación necesarios

- Columna cromatográfica con tubo de látex y pinza de regulación de goteo.

- Lana de vidrio (sólo en el caso en el que la columna no incluya una base de vidrio fritado).

- Tubos de centrífuga.

- Gradilla.

- Cubetas de medida para visible.

- Espectrofotómetro Spectronic.

Procedimiento operatorio

1) Preparación de la columna

Preparar en un vaso de precipitado una suspensión de alúmina en etanol (3-4 cucharadas de alúmina en 30 ml de etanol) y adicionarla a la columna en cuya base se ha situado un poco de lana de vidrio. Recoger varias veces parte del etanol adicionado sobre el vaso con la alúmina y terminar de trasvasar la misma a la columna. Obtener un depósito homogéneo de fase estacionaria de una altura comprendida entre 8 y 10 cm, manteniendo abierta la columna por su extremo inferior y evitando que el nivel de etanol descienda por debajo del de alúmina.

2) Separación de los componentes de la muestra

Abrir la llave hasta que el nivel de etanol esté aproximadamente 1 mm por encima de la capa de absorbente. Adicionar suavemente 2 ml de la muestra problema, evitando remover la fase estacionaria. Abrir la llave y dejar gotear hasta que el nivel de muestra llegue al adsorbente. A continuación se procede a eluir (separar) la banda correspondiente al azul de metileno mediante la adición de pequeñas fracciones (1-2 ml) de etanol. Para ello, se deja que gotee la fase móvil por la parte inferior de la columna y, se va recogiendo en tubos de centrífuga en fracciones de 3-4 ml.

Una vez eluido totalmente el azul de metileno se procede a la elución del anaranjado

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