TÉCNICAS GENETICAS

Avances en la Automatización de las Técnicas Genéticas.

La expresión fenotípica de las células está sujeta a condiciones de crecimiento que se ven influidas por la temperatura, pH, presencia de nutrientes, potencial de óxido-reducción, estrés químico y ambiental, actividad de agua, etc.

En este sentido, incluso los ensayos inmunológicos dependen de la expresión fenotípica de las células para producir antígenos diana que puedan ser detectados por anticuerpos específicos.

Por ello, la mayor parte del diagnóstico microbiológico recae en la detección de la expresión fenotípica de las células y está inherentemente sometido a variación. Por el contrario, los métodos genéticos se dirigen a la detección de características celulares mucho más estables contenidas en los ácidos nucleicos.

Una de las técnicas genéticas más sencillas para la identificación de un microorganismo diana en un alimento se basa en la hibridación de sus ácidos nucleicos con sondas genéticas conocidas (oligonucleótidos sintéticos). El sistema Genetrack (Framingham, Mass., USA) permite la detección de patógenos como Salmonella, Listeria, Campylobacter y Escherichia coli 0157:H7 en alimentos.

Inicialmente, estos kits utilizabansondas marcadas con compuestos radiactivos, pero los problemas inherentes a la utilización de estos marcadores (autorizaciones legales para utilizar compuestos radiactivos, instalaciones adecuadas, etc.) dieron paso al empleo de sondas marcadas con enzimas y diseñadas para hibridar en el ARN ribosómico de los microorganismos diana (una célula bacteriana puede contener de 1.000 a 10.000 copias de ARN ribosómico frente a una única copia de ADN cromosómico). Estos ensayos han sido evaluados ampliamente en diferentes laboratorios y la AOAC Internacional los ha aprobado para distintos tipos de alimentos. Más recientemente, Genetrack ha adaptado el sistema a placas de pocillos para una mejor automatización del ensayo.

En los últimos años es cada vez más frecuente en los laboratorios de microbiología de los alimentos el empleo de la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), para amplificar el ADN de los microorganismos diana y disponer así de una cantidad suficiente que permita su detección. Ideada por el científico Kary Mullis a mediados de la década de 1980, esta técnica ha cambiado el curso de las ciencias biomédicas más que cualquier otra técnica desarrollada durante el siglo XX. El gran éxito científico reside en que permite obtener in vitro un gran número de copias de fragmentos específicos de ADN, basándose en mecanismos similares a los empleados por la propia célula en la replicación del ADN durante la división celular. La reacción en cadena de la polimerasa consiste en la repetición cíclica de tres etapas:

1) Desnaturalización del ADN bicatenario presente en la muestra para separar las dos cadenas, mediante la aplicación de temperaturas superiores a 90 ºC.

2) Unión específica de los cebadores (oligonucleótidos sintéticos) a las cadenas sencillas mediante complementariedad de bases. La temperatura a la que se realiza esta unión (Ta, annealing temperature) es muy importante para controlar la especificidad de la reacción. La Ta depende de la composición de bases y del tamaño de los cebadores. Se suelen emplear dos cebadores que se unen cada uno a una cadena diferente, delimitando la secuencia diana que se pretende amplificar.

La selección de dichos cebadores constituye uno de los puntos más críticos del ensayo de PCR.

3) Extensión de la cadena de ADN a copiar a partir de los cebadores, utilizando los nucleótidos presentes en la solución. Dicha extensión la lleva a cabo la enzima ADN polimerasa, que inicia su actividad tras reconocer la unión de los cebadores a las cadenas de ADN de la muestra.

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