Hibridacion In Situ

HIBRIDACION IN SITU

La técnica de hibridación in situ está basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia.

La hibridación in situ es la hibridación de fragmentos marcados de ADN o ARN con secuencias complementarias (sondas) a ADN o ARN celular, que en condiciones apropiadas forman híbridos estables.

La hibridación in situ consiste en la desnaturalización del ADN O ARN por calor (95°C) y posteriormente añadir la sonda con el ADN o ARN marcado que hibridara con sus secuencias complementarias. El marcado de la sondas se puede hacer por radioactividad con P32, S35 o I125 y detectarse con una autorradiografía.

La hibridación in situ se utiliza en patología tumoral y en estudio de infecciones por ejemplo: cáncer de mama, neoplasias endocrinas, citomegalovirus o genomas virales

La hibridación en situ con fluorescencia (Fish): se utilizan sondas específicas para determinados cromosomas o secuencias de ellos. Al igual que en la otra técnica, se desnaturaliza la muestra, se incuba la muestra con formamida y pone un tampón salino para mantener la muestra desnaturalizada, posteriormente se hibrida con sondas especificas de determinados fragmentos de ADN o ARN que se quieren estudiar, se agrega un intermediario que sirva como puente para que la sonda pueda ser marcada con una sustancia fluorescente (Fluorocromo) que reconozca la sonda.

Esta técnica pone de manifiesto las alteraciones genéticas, este método se puede utilizar para para cromosomas en metafase como en interfase. El Fish tiene muchas aplicaciones en carcinomas, en la leucemia mieloide, en tumores sólidos como los de ovarios, es importante su aplicación en muestras prenatales para la identificación de anomalías cromosómicas como el síndrome de Down

Hibridación In situ Ultrastuctural.

Trata de estudiar la distribución de secuencias específicas de ácidos nucleicos, (el material de herencia) en células y tejidos , con ayuda del microscopio electrónico.

Una vez con el cultivo subconfluente ( 2-3 dias) se fijan durante una hora a temperatura ambiente , con una solución fijadora de paraformaaldehido al 4% buffer de fosfatos, posteriormente se enjuega con el mismo buffer y se procede a desnaturalizar el DNA de las células por medios químicos con NaOH colocando la rejilla de fomvar ( alcohol etílico congelado 70% y 95% helado) con cortes de agua destilada en ebullición de 3 a 5 min, se secan al aire y se incuban durante 24 hrs a 37 grados con la mezcla de la sonda que las contiene.

El DNA de la mezcla de hibridación se desnaturaliza por métodos físicos, sumergiéndolos en agua en ebullición en un tubo eppendorf durante 4 a 5 min. La reacción revela con el complejo ABC ( kit

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