Hibridación in situ Fluorescente

Hibridación in situ Fluorescente

También conocida como FISH es una técnica de laboratorio que se utiliza para detectar o localizar una secuencia de material genético teniendo la capacidad de ensayar y visualizar múltiples objetivos en una sola muestra. Se utilizan cortes de tejido, células o cromosomas de un individuo para después fijarlo en un portaobjetos teniendo la capacidad de hacer estas fluorescencias en el habitad del microorganismo. Esto se hace mediante el uso de una sonda marcada con fluorocromo que va dirigido a una región específica del cromosoma, siendo esta marcada para después poder verla directamente desde un microscopio.

Este método se ha utilizado en una gran cantidad de estudios donde se busca identificar microorganismos ya sea en muestras clínicas o ambientales, podemos ver diferencias desde aquí, ya que los métodos tradicionales de identificación por cultivo son muy tardados y se dice que únicamente el 0,3% de las bacterias del suelo tienen la característica de ser cultivables aquí es donde FISH tiene una mayor cantidad de bacterias identificables haciéndola posiblemente mejor a la hora de identificar sitios diana.

Protocolo

Se incluyen 4 pasos

1. Fijación y permeabilización de la muestra

1. El cultivo, la muestra o el tejido que contienen el microorganismo a identificar debe de ser fijado y permeabilizado para facilitar así la penetración de la sonda fluorescente dentro de la célula, así como para proteger al ARN de la degradación por ribonucleasas endógenas
2. Referido a facilitar la penetración hace referencia a que el oligonucleótido puede tener dificultades para penetrar la pared celular como en el caso de algunas GRAM positivas donde se debe de hacer un tratamiento enzimático en este proceso.

1. Hibridación

1. Es el proceso por el que la muestra desnaturalizada se le añade la sonda de interés que se unirá a la secuencia de; ARNr que se haya elegido

1. Lavado

1. Las laminas son lavadas con agua destilada para retirar la sonda que no se unió

1. Detección de las células marcadas a través del microscopio de epifluorescencia o confocal

1. Se realiza la visualización de la muestra lo que requiere un microscopio de epifluorescencia que debe de estar equipado con diversos filtros para los diversos espectros de color con los cuales dispone la técnica FISH.

Aplicaciones

1. El principal en nuestro entorno es la identificación de microrganismo de interés clínico

Dada la dificultad en los cultivos mencionada con anterioridad y para el tratamiento oportuno de infecciones se puede utilizar este tipo de métodos. Se han podido identificar el microbiota que ataca a la pulpa de los dientes.

Enfermedades mas comunes como la faringitis o la faringoamigdalitis que presenta un cuadro clínico inespecífico, pero se sabe que el principal causante es el estreptococo betahemolítico del grupo A también pueden Identificarse con FISH haciendo así una rápida y apropiada identificación ya que presenta una alta sensibilidad y especificidad, para poder iniciar lo mas pronto posible la antibioticoterapia.

Se habla también de infecciones sanguíneas donde un hallazgo de cocos GRAM positivos en racimos en una muestra de hemocultivo nos indica una bacteriemia, pero la relevancia del diagnóstico pues es identificar cual es el patógeno causante para su posterior tratamiento y también se han desarrollado sondas dirigidas a gen ribosómico de Staphylococcus aureus.

1. Determinación de estatus en cáncer

HER2 en cáncer de mama. La sonda marcada es complementaria a la región que va a codificar a la proteína HER2. A un tumor se le considera positivo para HER2 cuando presenta mas de 2 copias el gen por cada cromosoma 17

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