Hibridizacion in situ

In-Situ Hybridization

Por: N. Flores-De Jesús y Tamia Lozada

1. Fijar:

1. En un “scintillation vial” echar:

1. 8ml H2O
2. 1ml 10X MEM
3. 1ml 37% Formaldehído
4. 10 especímenes con etapa identificada.

1. Guardar @ 4°C ON.

1.   Deshidratar:

1. Decantar el MEMFA y echar 5ml H2O y 5ml de EtOH e incubar por 5 mint.
2. Decantar el 50%EtOH y echar 2.5ml H2O y 7.5ml EtOH e incubar por 5 mint.
3. Decantar el 75%EtOH y echar 10ml EtOH e incubar por 5 mint.
4. Remplazar el EtOH, por 100%EtOH fresco y almacenar @-20°C hasta que se vaya a continuar con el ensayo.

1. Rehidratar: 5 mint por lavado.

1. Remover los 10ml 100%EtOH del vial. Añadir 2.5ml H2O y 7.5ml 100% MeOH, incubar 5 mint.
2. Remover los 10ml del vial y añadir 5ml H2O y 5ml MeOH, incubar 5 mint.
3. Remover los 10ml del vial y añadir 2.5ml MeOH y 7.5ml PBS-T incubar 5 mint.
4. Remover los 10ml del vial y añadir 10ml PBST e incubar 5 mint. Repetir éste paso una vez más.

1. Permeabilizar los embriones:

1. Preparar “stocks solutions” de:

1. Proteinase K[27 mg/ml]i: 10μg/μl para añadir una concentración final de10μg/ml
2. Collagenase A: 1mg/10μl para añadir una concentración final de 2mg/ml.
3. Hyalorudinase: 20U/μl para añadir una concentración final de 20U/ml.

1. Preparar las soluciones para un volumen total de 10ml e incubar con los embriones @RT por 10 min en el nutator.
2. Luego se remueven los remanentes de la membrana manualmente.

1. Lavados:

1. Remover la solución y añadir 5 ml PBS-T, 5 min @RT en el nutator.
2. Realizar 2 lavados con 5ml 0.1M Trietanolamina 5 min @RT en el nutator.
3. Añadir 12.5μl Anhidro Acético incubar 5 min @RT en el nutator. (2 veces).
4. Hacer 2 lavados de 5min c/u con 5ml PBS-T.

1. Refijar:

1. Incubar 20 min con 10ml PBST suplementado con 4%w/v Paraformaldehído (poner mascarilla al preparar).

1. Lavados:

1. Realizar 4 lavados con 5ml PBS-T, 5 min @RT.
2. Último lavado; 1:1 PBS-T; Hybridization buffer, 10 min, @60°C, en shaking water bath.
3. Remover la solución y añadir 1ml hybridization buffer @60°C ON.

1. Hibridización: Preparar buffer de hibridización, 1-4μg/ml PROBE, incubar 5 min @75°C.

1. Pasar los especímenes a microtubos y añadir 1ml de hibridization buffer/PROBE; incubar @60°C ON.
2. Pasar los embriones a sus respectivos vials, remover el 1ml hibridization buffer/PROBE ( almacenar @-20°C, se puede reusar 2 veces más). Enjuagar los embriones con 5ml hibridization buffer fresco 10 min @60°C.
3. Realizar 3 lavados de 20 min c/u @60°C con 5ml 2X SSC.
4. DE NO HACER EL TRATAMIENTO DE RANasa SEGUIR EN LA LETRA J, lavados.

1. Tratamiento RNasa OPCIONAL:

1. Remplazar el 5ml 2X SSC por 5ml 2X SSC suplementado con 20μg/ml RNasa-A y 10μg/ml RNasa-T1.
2. Incubar 30 min @37°C.
3. Hacer 1 lavado con 5ml 2X SSC 10 min @RT.

1. Lavados:

1. Hacer 2 lavados c/u de 30 min, con 5ml 0.2X SSC @60°C.
2. Hacer 2 lavados c/u con 5ml 1X MAB por 10 min; el primero @60°C, el segundo @RT.

1. Incubación con anticuerpo (α-DIG):

1. Remplazar el 1X MAB por 1ml 1X Blocking Soln., incubar 1 hora @ RT.
2. Remplazar el  1X Blocking Solution por 1ml 1X MAB+2%BMB+ 1/2000 α-DIG. Incubar @4°C ON y/o 4hrs @RT. La solución con α-DIG puede reciclarse 3 veces.
3. Enjuagar con 2ml 1X MAB.
4. Realizar 4 lavados c/u de 1hr @RT con 5ml 1X MAB.
5. El último lavado se deja @4°C ON.

1. Preparación para Alkaline Phosphatase:

1. Lavar 2 veces, c/u 5 min, con 5ml de Alkaline Phosphatase Buffer (APB) @RT.

1. Tinción:

1. Remplazar el último lavado con 1 ml BM Purple, inc @RT hasta que la tinción sea visible. (puede tomar de 5min-24Hrs).

1. Para genes expresados fuertemente, utilizar Alkaline Phosphatase Buffer + 4.5μl/ml NBT+3.5μl/ml BCIP.

1. Monitorear la tinción; observando los embriones en un Petri dish bajo el microscopio. Acelerar o desacelerar la tinción alternando la temperatura de 4°C-37°C respectivamente.

1. BM Purple, puede dar 2 tonalidades de azul, en especial si hay regiones de intensa expresión genética. Por lo tanto, utilizar NBT/BCIP para genes con alta expresión.
2. Se puede usar como buffer alterno polyvinil alcohol, el cual reduce el background.

1. Cuando sea evidente la tinción, pasar los especímenes a un Petri dish con APB y observar por el microscopio. De haber especímenes con tinción pobre, devolverlos al vial hasta que la tinción sea la deseada.
2. Enjuagar los embriones 1 vez con 5ml APB.

1. Re-Fijar:

1. Decantar los 5ml APB, y refijar los embriones con 2ml de MEMFA, incubar @RT ON.
2. Decantar el MEMFA, y para disminuir “background”, enjuagar las veces necesarias los embriones con PBS-T+70% EtOH (10ml 1X PBST, 20ml H2O, 70ml 100% EtOH).

1. Bleaching: (Puede realizarse antes del día 1 y requiere volver a fijar los especímenes en MEMFA. Luego se continuaría como dicta el protocolo)  

1. Incubar @RT1 hr sobre luz con fondo reflectivo en el rocker, en 1%H2O2+ 5% formamida+ 0.5X SSC.
2. Transferir e incubar los embriones en MeOH @ -20°C, hasta que se tomen las fotos.

1. Lavado:

1. Para tomar mejores fotos, lavar los embriones en 1:2 Benzyl Alcohol/Benzyl Benzoate (SE RECICLA), al realizar éste lavado tiene que asegurarse que los embriones se encuentran deshidratados en MeOH.
2. Tomar las fotos y publicar.  

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