MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Ensayo de lipasa

La actividad de la lipasa se ensayó midiendo la cantidad de p-nitrofenol (p-NP) liberado del sustrato del éster p-NP, palmitato de p-NP (C16) y estearato de p-NP (C18). Los ésteres de p-NP se disolvieron en isopropanol a una concentración de 10 mM. La actividad de la lipasa total se analizó usando los sobrenadantes de las enzimas digestivas.

Los ensayos de actividad de lipasa estándar se realizaron en un sistema de reacción de 100 μl que consta de una concentración final de sustrato de ésteres p-NP 0,5 mM y el tampón (pH 8,0) de H3BO3 80 mM, H3PO4 80 mM, NaCl 300 mM, Triton X- al 0,3% 100 y 20% de glicerol. La mezcla de reacción con gradiente de concentraciones crecientes (1, 2, 3 y 4 μg) de proteína purificada se incubó a 37 ° C durante 40 min y se determinó la liberación de p-NP midiendo espectrofotométricamente a 405 nm. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que libera 1 μmol de p-NP por minuto a 37 ° C en condiciones de reacción estándar.

La especificidad del sustrato se determinó utilizando ésteres de p-NP con diferente lado alifático. La temperatura óptima de la reacción enzimática se determinó en la misma solución de sustrato a varias temperaturas que oscilan entre 35 ° C y 60 ° C. El pH óptimo para la actividad de la lipasa se determinó analizando la actividad hidrolítica en un rango de pH de 6,0 a 9,0, utilizando un método espectrofotométrico establecido. Los efectos del detergente no iónico Tween 20 y Tween 80, el detergente aniónico SDS y el inhibidor de serina proteinasa fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma-Aldrich) sobre las actividades de la lipasa se examinaron añadiendo gradiente de concentraciones crecientes de cada uno en el sistema de reacción. Todas las reacciones se realizaron por triplicado.

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