ADN Polimerasa

La PCR es un método rápido de amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas

dentro de una muestra. Habitualmente la reacción se diseña para permitir la amplificación

selectiva de una o varias secuencias diana de ADN presente en una mezcla compleja de

secuencias (por ejemplo ADN genómico total). Para que la amplificación sea posible es

absolutamente necesario disponer de un mínimo de información sobre la secuencia a

amplificar. Esta información permite la construcción de dos oligonucleótidos (oligos),

habitualmente de 15 a 30 nucleótidos de longitud, complementarios de los extremos 3' de

la secuencia diana, que actuaran como cebadores (iniciadores, en ingles primers) en la

reacción.

Cuando se mezclan con ADN genómico desnaturalizado, los cebadores se unen

específicamente a las secuencias complementarias de la región genómica que se quiere

amplificar, quedando sus extremos 3' OH enfrentados. Los oligos están diseñados para

que puedan iniciar la reacción de síntesis de ADN en presencia de una ADN polimerasa

termoestable adecuada y de los precursores de ADN (los cuatro desoxinucleótidos

trifosfato, dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Cada oligo servirá para iniciar la síntesis de una

hebra de ADN complementaria a una de las hebras del segmento de la diana, y las dos

hebras de nueva síntesis serán complementarias entre sí.

La PCR es una reacción en cadena porque las hebras de ADN de nueva síntesis sirven a

su vez de molde para reacciones de síntesis en ciclos posteriores. Tras unos 30 ciclos, la

PCR habrá generado aproximadamente un millón de copias de la secuencia diana

específica.

Una vez amplificado el ADN se dispone ya de cantidad suficiente como para que este

pueda ser caracterizado. Como en otros sistemas, se puede utilizar el método de

Souther, con digestión enzimática y análisis de los fragmentos por electroforesis en gel

de agarosa y tinción con bromuro de etidio y detectarlos como bandas discretas de un

tamaño específico; o bien, detectar directamente una cierta secuencia en el producto de

amplificación si se cuenta con sondas adecuadas.

Se utiliza una ADN polimerasa termoestable debido a que la reacción pasa por ciclos en

los que se cambia la temperatura, de esta manera se evita añadir la enzima

manualmente en cada ciclo.

Cada uno de los ciclos consta de las tres etapas siguientes:

i) Desnaturalización del ADN bicatenario presente en la muestra: típicamente

calentando la muestra a 93-95o

C, durante unos 30 segundos, se consigue la

separación de la doble hélice en dos cadenas sencillas por rotura de los enlaces de

hidrógeno y consiguiente

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