Aislamiento Leucocitos

Al estratificar una muestra de sangre sobre el ficoll-diatrizoato y centrifugar, las

células mononucleares se separan de las demás debido a diferencias de densidad. Como se mencionó, el ficoll aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a través del medio y sedimentan al fondo. Los granulocitos también sedimentan por su tamaño y densidad, y

por su tendencia a formar agregados. Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su

menor densidad, se quedan en la interfase entre el plasma y el medio (Figs.1.1 y 1.2), con

una contaminación relativamente baja de plaquetas y otros tipos celulares. Al final de la

centrifugación, los leucocitos mononucleares se recogen del anillo blanco que se forma en

la interfase entre el plasma y el ficoll-diatrizoato. E

Este aislamiento se puede realizar por varios métodos

pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de

densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida

como es el Ficoll-Hypaque. El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida

(compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos

y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células

mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos

será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica.

Este aislamiento se puede realizar por varios métodos pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque (Lymphoprep). El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica para nuestro estudio

Cargar 8 mL de sangre diluida con suero fisiológico en pipeta milimetrada y dispensar muy cuidadosamente y lentamente sobre el Ficoll-Hypaque en el tubo de centrifuga. Poner el tubo inclinado y apoyar la punta de la pipeta sobre la pared del tubo para dejar deslizar la sangre suavemente sobre el Ficoll y poder formar una interfase (Ficoll abajo y sangre arriba).

Extraer toda la banda de células mononucleares utilizando pipetas pasteur de plástico y dispensar en

Después se ubicaron lentamente sobre el gradiente de densidad Ficoll-Ipaque Plus (Amersham, São Paulo, Brasil) para separación de las células en la densidad 1,077g/mL y proporción de 2:1 (médula ósea: gradiente) (15). Luego de la centrifugación a 495 g por 30 min a 15 ºC, se removió el sobrenadante y el anillo celular formado sobre la solución de Ficoll fue cuidadosamente colectado mediante una pipeta

Las células mononucleares son células de sangre periférica, incluyen a los linfocitos y

los monocitos y se pueden aislar por centrifugación en un gradiente de densidad con

Ficoll-Hypaque. Los monocitos son una de las células que componen al sistema de

defensa y son las células precursoras de los macrófagos, las cuales proporcionan una

primera línea de defensa contra la infección y se activan por procesos inflamatorios.

Para poder llevar a cabo su función de defensa los monocitos expresan en la superficie

de su membrana una proteína glicosilfosfatidilinositol denominada CD14. El CD14 es

un receptor que se encarga del reconocimiento de los componentes de las bacterias

Gram. negativas como

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