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Ultracentrifugación

Consiste en someter una mezcla homogeneizada a una velocidad de rotación muy alta, de forma que, a velocidades más lentas, sedimentan los componentes más grandes, y a velocidades mayores, los componentes más pequeños. Es decir, que aunque las masas de diferentes partículas sean muy similares, sedimentan en tiempos distintos. El instrumento utilizado es la ultracentrífuga.

La ultracentrífuga que fue desarrollada hacia 1923 por el bioquímico sueco The S vedberg puede alcanzar velocidades rotacionales de hasta 100000 rpm.Esto genera un campo centrifugo en exceso de 800000 g. Svedberg demostró por primera vez que la proteínas son macromoléculas con composiciones homogéneas y muchas de ellas contienen subunidades.

La velocidad con la que una particula sedimenta en la ultracentrifugacion se relaciona con su masa (la densidad de la solución y la forma de la particula también afectan la velocidad de sedimentación .

El coeficiente de sedimentación de una proteína (su velocidad de sedimentación por unidad de fuerza centrifuga) se expresa generalmente en unidades de 10-13 s conocidas como svedbergs.

Una ultracentrifugadora consiste en una cámara al vacío y refrigerada que contiene un rotor, el cual es manejado por un motor eléctrico capaz de girar a alta velocidad. Las muestras son ubicadas en tubos que se encuentran dentro del rotor o sujetos a este. La velocidad rotacional puede alcanzar más de 100.000 rpm para el modelo “floor”, 150.000 rpm para el modelo “bench-top” (Beckman Optima Max-XP), generando fuerzas centrifugas entre 800.000g y 1.000.000g.

Centrifugación diferencial o pelleting

En este método, el tubo de la centrífuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de la solución de la muestra, a través de la centrifugación se obtiene una separación de dos fracciones: Un pellet (sedimento) que contiene la partícula sedimentada y un sobrenadante con la fracción no sedimentada de la solución. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el pellet, o podría estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamaño y/o de las condiciones de centrifugación. El pellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y esta contaminado con cualquier partícula no sedimentada que estuviera en el fondo de el tubo. Las dos fracciones son recuperadas por decantación de la solución sobrenadante del pellet. El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener una mayor purificación con la formación de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido en un pequeño volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.

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