Aumento del Sulfuro de Hidrógeno

Aumento del Sulfuro de Hidrógeno , el glutamato-cisteína subunidad catalítica de la ligasa, glutamato-cisteína ligasa modificador Subunidad, y glutatión e inhibición de la secreción de interleucina-1b en monocitos expuestos a niveles altos de glucosa

Abstracto.

La deficiencia del glutatión (GSH) y el aumento de la interleucina-1b (IL-1b) están vinculados a la progresión de la vascular inflamación y aterosclerosis. El consumo de vegetales ricos en sulfuro se conoce para disminuir el riesgo de aterosclerosis. Este estudio examinó la hipótesis de que el aumento del sulfuro de hidrógeno (H2S) el glutamato subunidad catalítica cisteína ligasa (GCLC) y GSH inhibe la IL-1b en un modelo celular de monocitos. U937 monocitos fueron suplementados con H2S (0-12,5 mM) durante 2 horas y luego expuestos a un control o altos de glucosa (HG, 25 mM) durante 22 horas. Los niveles de GCLC y modificador ligasa-glutamato cisteína de la expresión de la subunidad (GCLM) se determinaron por Western Blot y GSH utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y la IL-1b utilizando inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA). El aumento significativo de H2S (P <0,05) y la expresión de GCLC y GCLM, y la formación de GSH, y la secreción de IL-1b es inhibido en los controles y los monocitos tratados con HG. Es la primera demostración de la regulación positiva de H2S GCLC y GSH y la inhibición de los niveles de IL-1b, que puede ser lo que media los efectos beneficiosos de los compuestos ricos en H2S en la mitigación de la patogénesis del síndrome metabólico y la aterosclerosis.

Introducción.

Varios vehículos, tales como ajo, cebollas, puerros, brócoli, y chalotes, son conocidos por ser una rica fuente de sulfuro de hidrógeno (H2S). Los estudios epidemiológicos sugieren que el consumo de estos vegetales pueden proteger contra cáncer en seres humanos y tiene el potencial de prevenir la resistencia a la insulina y la aterosclerosis en los seres humanos y modelos animales. Sin embargo, el mecanismo por el cual H2S en estos vegetales proporciona el efecto beneficioso en la reducción de ateroesclerosis no se conoce. La interleucina-1b (IL-1b) es secretada por muchos tejidos y actúa tanto local como sistémicamente. La sobreexpresión del receptor de IL-1b o la exposición a IL-1b aumenta la progresión de la aterosclerosis, mientras que desmontables de IL-1b o la inhibición de IL-1b reduce los biomarcadores y lesiones asociadas con la aterosclerosis en estudios con animales. Ensayos clínicos humanos utilizando anakinra, un antagonista del receptor de IL-1, o aquellos que examinan la inhibición específica de IL-1b utilizando canakinumab, un anticuerpo monoclonal para IL-1b, han demostrado una reducción significativa en los biomarcadores de inflamación vascular. Varias revisiones recientes han discutido el potencial de la inhibición de IL-1b como una terapia prometedora para prevenir o detener la progresión de la enfermedad vascular ateroesclerótica. El estudio muestra por primera vez que el H2S regula el aumento de la subunidad ligasa-glutamato cisteína catalítica (GCLC) y modificador ligasa-glutamato cisteína de la subunidad (GCLM), aumenta el glutatión celular (GSH), y disminuye los niveles de IL-1b. El potencial de H2S para inhibir los niveles de IL-1b observados en este estudio podría proporcionar pruebas de un nuevo mecanismo por el que la suplementación dietética con H2S-ricos en verduras podría reducir la progresión del síndrome metabólico y la aterosclerosis.

Materiales y Métodos

El tratamiento con HG y de H2S y estudios de inmunotransferencia.

La línea celular de monocitos U937 se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) y se mantuvo como células antes descritas (106 / ml) fueron pre-tratados con tres diferentes concentraciones de H2S (012,5 mM) durante 2 horas, seguido a una exposición de alta de glucosa (25mmHg) en las próximas 24 hr. Las células de control fueron expuestas a medios con glucosa 7 mM, porque la glucosa se metaboliza pero no es sustituido en los estudios de cultivo de células, la glucosa y 7 mM no conduce a una deficiencia de glucosa a las 24 h de incubación. Después del tratamiento, las células se lisaron en ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA). Los lisados fueron aprobados por centrifugación, y el total de las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un ácido bicinconínico (BCA). Los anticuerpos para GCLC (73 kD), GCLM (31 kD), se compraron de Abcam (Cambridge, MA). La intensidad de cada banda de inmunotransferencia se midió utilizando la herramienta de histograma de Adobe Photoshop CS5. Sulfuro de sodio (Alfa Aesar, Ward Hill, MA) se utilizó como una fuente de H2S para el tratamiento de los monocitos. Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), a menos se indique lo contrario.

GSH, actividad GR, IL-1b, y ensayos de viabilidad celular

Las concentraciones de GSH se determinaron utilizando el método de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) como se describe antes. La concentración de GSH se expresó por volumen de suspensión celular. La actividad GR se determinó utilizando un protocolo descrito anteriormente. Se expresó como la tasa de disminución de la absorbancia a 340 nm / min debido a la oxidación de la nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (NADPH) por GR, y se normalizó por miligramo de proteína. Todos los controles y las normas apropiadas según lo especificado por el kit de cada fabricante se utilizaron para el ensayo de IL-1b, realizaron con ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) kits (R & D Systems, Minneapolis, MN). En el ensayo de citoquina, se analizaron muestras de control cada vez para comprobar la variación de placa a placa en diferentes días de análisis. La viabilidad de las células se determinó usando el bioensayo de reducción de Alamar azul (Alamar Biosciences, Sacramento, CA).

Resultados y discusión

La Figura 1 muestra la suplementación del aumento significativo de H2S de la expresión GCLC en monocitos expuestos a HG. El efecto de H2S en la regulación positiva de GCLM también se observó cuando los monocitos fueron expuestos a controlar los niveles de Hg. Del mismo modo, hubo significativamente más formación de GSH en H2S-monocitos suplementados. La suplementación de H2S no tuvo ningún efecto sobre la actividad de GR (datos no mostrados).

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