Bacillus Subtilis.

1. Introducción

El bacillus subtilis es una bacteria bacilo Gram positiva, aeróbica, que se encuentra comúnmente en el suelo. Esta bacteria fue descubierta por Christian Gottfried Ehrenberg  en 1835 y originalmente fue conocida como  Vibrio subtilis. Fue renombrada como Bacillus subtilis por Ferdinand Cohn en 1872. Esta bacteria también es conocida como grass bacillus o Bacillus globigii. Pertenece al reino Bacteria, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae, género Bacillus, especie subtilis. Se ha descubierto que el Bacillus subtilis produce ciertos compuestos de bajo peso molecular con mucha afinidad por el hierro, evitando la germinación de las esporas de hongos patógenos. También se sabe que puede ser usada para el control de enfermedades de los animales, como la salmonelosis, gracias a su capacidad para desplazar y competir por el sustrato que las bacterias patógenas necesitan para crecer y secretando sustancias con características antibióticas. Estos microorganismos son parásitos ya que se alojan en las raíces de las plantas o en los intestinos de los animales pero no son patógenos, al contrario, los combaten. También se pueden encontrar en la piel o el tracto digestivo humano aunque es sumamente raro que este procarionte colonice el cuerpo humano.  Estas bacterias tienen una forma cilíndrica, con un largo de unos diez micrómetros. A nivel macroscópico la colonia en un agar es blanca y circular.

        El ADN por las siglas de Acido Desoxirribonucleico, es una molécula de gran tamaño que guarda y transmite de generación en generación toda la información necesaria para el desarrollo de todas las funciones biológicas de un organismo. Los procariontes contienen todo su genoma en una sola molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena circular, denominado así, el cromosoma bacteriano. La palabra procarionte significa “antes del núcleo”, lo cual nos recuerda que los primeros procariontes evolucionaron antes que los primeros eucariontes. Los procariontes son unicelulares y como grupo constituyen las formas de vida más pequeña y de mayor diversidad metabólica conocidas. La extracción de ADN consta de varias etapas. En primer lugar hay que romper la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. Después debe romperse la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Luego de esto el ADN debe ser purificado, para esto usualmente se utiliza una mezcla fenol-cloroformo. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan diluirlo o dañarlo. Para aislar el ADN hay que precipitarlo en alcohol o etanol al 70%. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desdobla y precipita en la interface entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

El ADN tiene un peso molecular el cual se puede determinar gracias a la electroforesis en gel. Se le conoce como electroforesis en gel al proceso de separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar». La técnica de electroforesis en gel de agarosa consiste en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una placa de gel la cual tiene poros de distintos tamaños donde las moléculas de mayor tamaño quedan incrustadas mientras que las de menos tamaño cruzan, lo que quiere decir que la migración de la molécula de ADN es directamente proporcional a su tamaño.

El ADN puede cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia de luz ultravioleta. Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un cociente. Dado que las proteínas absorben a 280nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN puro son aproximadamente de 1.8 y 2.0. Si el resultado es menor de 1.7 significa que la mezcla está contaminada y si resulta mayor de 2.0 es que hace falta diluirla.

El objetivo de este experimento es poder determinar el tamaño del ADN y cuantificar el total de este en una bacteria, en este caso Bacillus subtilis. El problema planteado durante el experimento es si el método enzimático de extracción de ADN es el más útil o adecuado para la extracción del mismo de la bacteria Bacillus subtilis. Se predijo que el mismo ciertamente es el más útil ya que no expone zonas donde el ADN se encuentra degradado, además de que es eficiente para obtener un ADN de peso molecular.

1. Métodos y Materiales

1. Extracción del ADN de Bacillus subtilis

Primero, se añadió 2 ml del cultivo líquido de bacteria a un micro tubo. Luego, este fue colocado en la centrífuga durante 3 minutos a máxima velocidad. Al terminar, el sobrenadante fue descartado. Estos primeros tres pasos fueron repetidos. Posteriormente, se añadieron 500µl de amortiguador de lisis, lo que se mezcló con un vortex por 30 segundos y luego se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente. Para purificar el ADN y limpiarlo de contaminantes como proteína, se le añadieron 150  de acetato de potasio 5M y se mezcló en el vortex por 30 segundos. Al cabo de los 30 segundos, el micro tubo fue colocado en la centrífuga nuevamente, pero esta vez a 12,000rpm durante 3 minutos. Al cabo de los 3 minutos, el sobrenadante fue transferido a un nuevo micro tubo que fue situado en la centrífuga a la misma velocidad y durante el mismo tiempo que el anterior. Su sobrenadante, el cual contiene el ADN, fue transferido a un micro tubo nuevo de 1.5ml. Próximamente, para precipitar el ADN, es decir, para recuperarlo de la fase acuosa y remover residuos de fenol y cloroformo, se le añadió la misma cantidad de isopropanol, 1.5ml, y se mezcló invirtiéndolo 5 veces. Luego, el micro tubo fue puesto a centrifugar a 12,000rpm durante 5 minutos y al culminar se descartó el sobrenadante. Seguidamente, se lavó el pellet, el cual contiene su DNA, con 500µl de etanol al 70% y fue colocado en la centrífuga por 5 minutos a 12,000rpm. Nuevamente, al finalizar la centrifugación, se removió el sobrenadante, el que contiene solo alcohol, y se descartó. Por último, se dejó secar el tubo a temperatura ambiente y, para disolver ADN para utilizarlo y cuantificarlo posteriormente, el “pellet” fue re suspendido en 50 µl de dH2O (agua des ionizada a pH 7-8). [pic 1]

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