Bioquimica

Guía 7. Extracción y verificación de la actividad de las enzimas: succínico deshidrogenasa y citocromo oxidasa y estudio del efecto de algunos inhibidores

I. EL PROBLEMA

Realizar experimentalmente la extracción de enzimas a partir de un tejido animal.

Verificar in vitro la actividad de las enzimas que se extrajeron mediante el uso de aceptores electrónicos coloreados.

Reconocer el efecto de los inhibidores en la actividad de las enzimas y sobre la fosforilación oxidativa y el ciclo de Krebs.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

La mitocondria es el organelo citoplasmático en donde se lleva a cabo la respiración celular representada en vías metabólicas como el ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa. Posee dos membranas: la externa altamente permeable por proteínas de membrana llamadas porinas y la interna con pliegues o crestas y de permeabilidad alatemnte selectiva (ver figura 1).

Figura 1. La mitocondria

El ciclo de Krebs

Es una ruta aerobia cuyos complejos multienzimáticos se encuentran localizados en la matriz mitocondrial con excepción de la succínico deshidrogenasa proteína integral de la membrana interna.

Este proceso metabólico permite la descarboxilación de los esqueletos carbonados que le llegan en forma de Acetil CoA, provenientes de diferentes compuestos (carbohidratos, ácidos grasos, aminoácidos). Esta vía metabólica oxidativa está asociada a la reducción de las coenzimas FAD y NAD+, que finalmente ingresan a la cadena de transporte electrónico para su reoxidación (ver figura 2).

Figura 2. Ciclo de Krebs

Figura 2. Ciclo de krebs

Acción de la succínico deshidrogenasa.

La succínico deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa o complejo II es una enzima que remueve dos protones y dos electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidación asociada a la coenzima FAD+, que transfiere los electrones a la cadena de transporte electrónico. Este proceso lo inhibe en forma competitiva la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el malonato, oxalacetato y oxalato, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, situación que genera la acumulación de succinato.

El proceso se puede observar in vitro mediante el uso de un aceptor electrónico artificial como el azul de metileno que es coloreado en su estado oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida que se reoxida la coenzima FAD. Cuando éste indicador de oxido – reducción se encuentra en contacto con el O2 del aire se reoxida tomando de nuevo la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno. Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se reoxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una capa de aceite mineral.

La cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa

La cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria como parte de la fosforilación oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroproteínas. (ver figura 3)

A través de la cadena de transporte de electrones se realiza la reoxidación de las coenzimas NADH+ H+ y FADH2 producidas en las rutas catabólicas, ya que permite el transporte de los electrones hasta el O2, que es el aceptor final reduciéndose para formar agua.

Este flujo de electrones es exergónico por esto tres complejos enzimáticos de la cadena respiratoria utilizan la energía liberada para bombear protones al espacio intermembrana de las mitocondrias, generando un potencial electroquímico que pormueve después el regreso de los protones a la matriz mitocondrial y la síntesís de ATP através del complejo V o la ATP sintasa.

Acción de la citocromo oxidasa.

El complejo citocromo oxidasa o complejo IV es el componente final de la cadena respiratoria y está constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu ++. Aproximadamente el 90% del consumo celular del oxígeno se debe a la acción de este complejo que cataliza la reducción del oxígeno para formar agua.

Figura 3. Cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa

Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores más fuertes como es el caso de ión cianuro (CN-), azida (N3-), monóxido de carbono (CO) y otros inhibidores que bloquean irreversiblemente este complejo enzimático. Con ello se ve interrumpido el transporte electrónico y se deja de utilizar el O2 generando una condición de cianosis celular.

La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de aceptores electrónicos artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos de los complejos de la cadena respiratoria. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.

La siguiente ecuación química representa la acción de esta sustancia indicadora de

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