DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE UNA PROTEINA.

DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE UNA PROTEINA.

La estructura primaria de una proteína puede determinarse mediante una serie de pasos que se describen a continuación:

1- Separación de las cadenas polipeptídicas individuales (si las hubiera) por hidrólisis ácida o básica o distintas concentraciones de sales (estructura cuaternaria).

2- Ruptura (reducción) de los puentes bisulfuro (con mercaptoetanol) y protección de los grupos SH formados por alquilación (adicionar grupos alquilo= R) con iodoacetato para que no vuelvan a reaccionar (estructura terciaria).

3- Hidrólisis total de los enlaces peptídicos de la proteína y determinación de la composición de aminoácidos (estructura primaria) (esta reacción se lleva a cabo a 100oC durante 24h, con vacío y concentración del agente hidrolizante 6N).

4- Identificación de los grupos terminales.

a) Extremo N terminal (primer aminoácido de la proteína) utilizando el reactivo 2,4-dinitrofluorbenceno (DNFB), que reacciona con todos los grupos amino presentes (también con los que están en los grupos R). También pueden utilizarse el feniltioisocianato o el cloruro de dansilo.

b) Extremo C terminal con la enzima carboxipeptidasa, específica de grupo carboxilo .

5- Hidrólisis suave, con la cual se consiguen fragmentos polipeptídicos, que luego se secuencian igual que en el punto 3.

6- Idem punto anterior en distintas condiciones para obtener otros patrones de corte (por ejemplo, la quimotripsina es una enzima endopeptidasa que corta específicamente los enlaces en los que participan aminoácidos aromáticos: fenilalanina, triptofano, tirosina).

7- Análisis de la información obtenida en los pasos anteriores y propuesta de una estructura.

8- Ubicación de los puentes bisulfuro y de los grupos amida.

2-a) Reducción de los puentes disulfuro (con β-mercaptoetanol)

2-b) Alquilación de los grupos sulfhidrilos

3- Hidrólisis total: se realiza por calefacción a 100-120ºC en HCl 6N por ~24 h y la composición en aminoácidos se determina en el analizador de Aminoácidos (resina de intercambio iónico automatizada).

4- Determinación de los extremos N terminal y C terminal

4- a) Determinación del extremo N-terminal por el Método de Sanger: todos los grupos NH2 libres (Nt) y R de Lys y Arg reaccionan con el 2,4 Dinitrofenilbenceno (DNFB).

4-b) Determinación del extremo N terminal por el método de Edman (fenilisotiocianato),

la cadena permanece intacta, permite determinaciones secuenciales (automatizadas)

Cada derivado de aminoácido que se va separando y se analiza por cromatografía gaseosa:

4-c) El extremo C-terminal se puede determinar por:

• Reducción con borohidruro de litio (BH4Li): el COOH se reduce a OH, luego por hidrólisis ácida se liberan los distintos Aminoácidos y el amino alcohol.

• Hidracinólisis: todos los Aminoácidos se convierten en hidracidas excepto el Ct

• Enzimáticamente con carboxipeptidasa: esta enzima reconoce específicamente el resto Ct y lo libera por hidrólisis. El principal problema es que al irse separando el primer Ct, ya comienza a atacar al polipéptido

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