DETERMINACIÓN DE LAS ACTIVIDADES NITRATO Y NITRITO REDUCTASA EN PLANTAS. EFECTO DE LA NUTRICIÓN NITROGENADA
Enviado por albpenu • 27 de Abril de 2016 • Documentos de Investigación • 690 Palabras (3 Páginas) • 297 Visitas
PRÁCTICA 2: “DETERMINACIÓN DE LAS ACTIVIDADES NITRATO Y NITRITO REDUCTASA EN PLANTAS. EFECTO DE LA NUTRICIÓN NITROGENADA.”
OBJETIVO
Consiste en la determinación de las actividades nitrato y nitrito reductasa en plantas de pepino, y estudiar el efecto de la nutrición nitrogenada sobre ambas enzimas.
MEDIDA DE LAS ACTIVIDADES NITRATO Y NITRITO REDUCTASA (GRIESS-ILOSWAY)
- ACTIVIDAD IN VITRO NITRATO REDUCTASA (NR)
[pic 1]
El ensayo de la actividad in vitro nitrato reductasa se basa en la medida colorimétrica del nitrito formado como consecuencia de la reducción de nitrato. La determinación de nitrito se hace mediante la reacción de Griess-Ilosway. Por lo que en primer lugar, se realizará una curva de calibrado de nitrito.
- Recta de calibrado de nitrito
TUBOS | H2O (mL) | NaNO2 0.1 mM (mL) | Absorbancia a 540 nm | nmoles nitrito |
1 | 3 | 0 | 0 | 0 |
2 | 2,9 | 0,1 | 0,091 | 10 |
3 | 2,8 | 0,2 | 0,183 | 20 |
4 | 2,7 | 0,3 | 0,291 | 30 |
5 | 2,6 | 0,4 | 0,353 | 40 |
6 | 2,5 | 0,5 | 0,447 | 50 |
7 | 2,4 | 0,6 | 0,520 | 60 |
8 | 2,2 | 0,8 | 0,699 | 80 |
9 | 2 | 1 | 0,878 | 100 |
Representación gráfica en Excel de la relación de nmoles de nitrito frente a la absorbancia a 540 nm.
[pic 2]
[pic 3]
- Medida de la actividad de la NR
Para calcularla hacemos uso de la recta de calibrado preparada anteriormente con concentraciones conocidas de nitrito.
Condiciones de cultivo. Composición nitrogenada de las disoluciones nutritivas | Absorbancia a 540 nm. Nitrato reductasa |
- N (sin nitrógeno) | 0,142 |
NO3- (con nitrato) | 0,539 |
NH4+ (con amonio) | 0,329 |
NO3- + NH4+ (con ambas) | 0,28 |
La mezcla de incubación para la medida se hace en eppendorfs en un volumen final de 1 mL.
- N
NO3-
NH4+
NO3- + NH4+
Conclusión según los resultados:
Cuando no añadimos a la muestra nitrógeno, no hay actividad de la nitrato reductasa (NR), no se forma nitrito. En cambio, cuando lo que ponemos en la muestra es nitrato la actividad de la NR aumenta mucho, cosa que no ocurre cuando lo que añadimos es amonio, con el que la actividad de esta enzima es muy baja. Podemos observar que la actividad de la NR es aditiva, ya que al añadir a la muestra nitrato más amonio, la actividad de NR y, por tanto, la formación de nitrito aumentan más que cuando ponemos solo nitrato.
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