Determinación De Actividad Enzimatica

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son catalizadores biológicos. Estas son protagonistas fundamentales en los procesos del metabolismo celular. Una enzima actúa solo en determinadas moléculas, llamadas sustratos (es decir, reactivos) mientras que deja el resto del sistema sin afectar. [1]

Se puede escribir una reacción enzimática sencilla como

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

En donde E, S y P representan las enzimas, el sustrato y el producto, respectivamente. ES y EP son complejos transitorios de la enzima como el sustrato y como el producto respectivamente. [2]

La reacción química catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reacción no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catálisis, las enzimas no alteran el equilibrio de la reacción entre sustrato y producto.

Sin embargo, al contrario que las reacciones químicas las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor número de centros catalíticos estarán ocupados, los que incrementará la eficiencia de la reacción, hasta el momento en que todos los sitios posibles estén ocupados. En ese momento se habrá alcanzado el punto de saturación de la enzima y, aunque se añada más sustrato no aumentará más la eficiencia. [3]

Para estudiar el mecanismo de una reacción catalizada enzimáticamente consiste en la determinación de la velocidad de la reacción, una disciplina conocida como cinética enzimática. [4]

En este tipo de gráfica se puede obtener una aproximación de Vmax por extrapolación debido a que V0 se acerca pero nunca alcanzara a Vmax. La concentración es Km la constante de Michaelis.

A concentraciones de sustrato relativamente bajas, V0 aumenta casi linealmente con el incremento de [S]. A mayores concentraciones de sustrato, V0 aumenta a incrementos cada vez menores en respuestas a incrementos de [S]. Finalmente, se alcanza un punto más allá del cual se dan incrementos pequeñísimos de V0 con el incremento de [S]. Esta meseta se denomina velocidad máxima, Vmax. [5]

La curva que representa la relación entre [S] y V0, se puede expresar algebraicamente mediante la ecuación Michaelis-Menten:

V =(Vmax[S])/(Km+[S])

Esta se puede transformar algebraicamente en formas más útiles para representar los datos experimentales. Una transformación común se deduce simplemente tomando los inversos en ambos miembros de la ecuación de Michaelis-Menten se transforma en ecuación Lineweaver-Burk:

1/V= Km/(Vmax [S])+ 1/Vmax

OBJETIVOS

Determinar la curva de calibración de la formación del p-nitrofenol para obtener su concentración.

Determinar la actividad enzimática de la fosfatasa ácida del germen de trigo.

Calcular las concentraciones finales de cada reactivo.

Determinar los parámetros cinéticos como la velocidad máxima y la constante de Michaelis-Menten (Km) para el p-nitrofenil fosfato (NPP).

MATERIALES

Amortiguador citrato de sodio 0,1 M; EDTA 0,15 M pH 5,0

Sustrato p-nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2,5 mM

Solución de p-nitrofenol 60 μM en NaOH 0,02 M

Solución de 0,02 M NaOH

Solución stock de enzima 5 mg/mL en BSA 0,1% diluida 1:20

Baño termoregulado a 37 °C

Solución de 0,1 M NaOH

Tubos de ensayo

Agua destilada

Micropipetas

MÉTODOS

Experiencia A: Curva de Calibración para la formación de p-nitrofenol.

Preparar 6 tubos de ensayos de 15 mL, con 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 mL de una solución de p-nitrofenol 60 μM y enrasar cada uno de los tubos a 6mL de volumen final con NaOH 0,02M. Mezclar y transferir a la cubeta para leer absorbancia a 405 nm. El tubo blanco es el que no tiene p-nitrofenol y se calibra el equipo.

Experiencia B: Determinación de la actividad de la fosfatasa ácida de Germen de trigo.

Preparar 4 tubos de ensayo 15 mL, que contengan 2,0 mL de amortiguador citrato de sodio 0,1M; EDTA 0,15M, pH 5,0 y 2,0 mL de sustrato NPP 2,5 nM. Luego, llevar baño termoregulado a 37 °C por 2 minutos y luego se adicionó 1mL de enzima (1:20). Al mismo tiempo se prepararon 4 tubos con 5,5 mL de NaOH 0,02M. Las 4 soluciones preparadas anteriormente se incubaron en el baño termoregulado durante 0 minutos el tubo 1 (que corresponde al tiempo cero), 2 minutos el tubo 2, 10 minutos el tubo 3 y 20 minutos el tubo 4. Se sacó una alícuota de 500 μL de cada tubo y se adicionaron a los tubos con NaOH. Finalmente determinar la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos, usando como blanco el tiempo cero.

Experiencia C: Determinación de la constante de Michaelis-Menten para p-nitrofenilfosfato y Vmax.

Preparar 6 tubos de ensayo que contengan 0; 50; 100; 200; 500; 1000 μL de sustrato NPP 2,5 mM. Agregar 2,0 mL de amortiguador citrato de sodio 0,1M, pH 5,0; EDTA a cada tubo y agregar agua destilada para llevar a un volumen final de 4,5 mL.

Pre-incubar los tubos a 37 °C por 2 minutos y adicionar 500 μL de la solución de fosfatasa ácida. Mezclar bien e incubar 15 minutos a 37 °C en baño termoregulado, se detiene la reacción en los tubos y de cada uno se saca una alícuota de 500 μL y se añaden por separado a otros tubos de ensayos, que contienen previamente 5,5 mL de NaOH. Posteriormente se leen la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos.

RESULTADOS

Parte I: Determinación de la actividad enzimática de la Fosfatasa Ácida de Germen de Trigo.

Experiencia A: Curva de calibración para la formación de p-nitrofenol: Las absorbancias medidas a una λ = 405 nm de las diferentes disoluciones de p-nitrofenol preparadas, se observan en la siente tabla:

Tabla 1: Cantidades de NPP (6,0 μ) y de NaOH (0,02 M) añadidos a cada tubo, para alcanzar las diferentes concentraciones de NPP (μM). Ademas se pueden observar las absorbancias obtenidas a una λ = 405 nm para cada tubo.

Tubos NPP (60 μM) NaOH

(0,02 M) Concentración NPP (μM) μmoles NPP Absorbancia

1 0 mL 6 mL 0 0,00 0,000

2 1 mL 5 mL 10 0,06 0,638

3 2 mL 4 mL 20 0,12 1,279

4 3 mL 3 mL 30 0,18 1,812

5 4 mL 2 mL 40 0,24 2,137

6 5 mL 1 mL 50 0,30 2,521

Cálculo de concentraciones de NPP en cada tubo.

Ejemplo tubo 5: C1 x V1 = C2 x V2

60 μM x 4 mL = C2 x 6 mL

C2 = 40 μM

Cálculo de μmoles de NPP

Ejemplo tubo 2: 10 μmol → 1000 mL

X μmol → 6 mL

X = 0,06 μmol de NPP

Gráfico N°1: Absorbancia v/s la Cantidad de p-nitrofenol.

Ecuación de la recta arrojada por Regresión Lineal:

Pendiente: 8,1381

Intercepto: 0,1381

Coef. Correlación: 0.9909

y = mx + n

y = 8,1381x + 0,1381

Experiencia B: Determinación de la actividad de la fosfatasa ácida de germen de trigo.

Tabla 2: Tiempo de incubación (min) para cada tubo que contiene citrato de sodio (0,1 M), NPP (2,5 nM) y encima (mL)

Tubo Tiempo de Incubación (min) Citrato de Sodio (0,1 M) NPP (2,5 nM) Enzima (mL)

1 0 2 mL 2 mL 1

2 5 2 mL 2 mL 1

3 10 2 mL 2 mL 1

4 20 2 mL 2 mL 1

Luego del tiempo de incubación correspondiente para cada tubo, se tomó una alícuota de 05 mL de la solución con enzima, adicionándola a tubos que contenían NaOH, para luego medir absorbancia.

Tabla 3: 5,5 mL de NaOH (0,1 M) añadido a cada tubo, además se agregó 0,5 mL de los tubos preparados anteriormente. Resultados de la absorbancia para cada tubo medida a una λ = 405 nm.

Tiempo (min) NaOH (0,1M) + Alícuota de cada solución Absorbancia

0 5,5 mL + 0,5 mL de tubo N°1 0,000

5 5,5 mL + 0,5 mL de tubo N°2 0,043

10 5,5 mL + 0,5 mL de tubo N°3 0,066

20 5,5 mL + 0,5 mL de tubo N°4 0,105

El blanco utilizado para la medición de absorbancia fue solución de NaOH 0,1 M

Cálculo de μmol existente en Pi:

Utilizando la ecuación de la recta obtenida con la curva de calibración (Gráfico N°1), se determinara los μmol de p-nitrofenol formados a los 0, 5, 10 y 20 minutos de reacción.

Función de la curva de calibración

y= 8,1381x + 0,1381

Dónde:

A = y = Absorbancia

m= 8,3976 = Pendiente

C = C = μmol de Pi

b = 0,1381 = Intercepto

Despejando:

X=(y-0,1381)/8,3976

Tubo N°3: Tiempo 10’ – Absorbancia: 0,066

X=(0,066-0,1381)/8,3976

X=-0,0086 μmol Pi

Como se midió una absorbancia en la solución de tiempo 0’ y con esta se obtienen los μmol de Pi, estos fueron restados a cada solución de tiempo 5’, 10’ y 20’ para lograr obtener los resultados reales y luego lograr obtener la velocidad inicial y actividad enzimática de cada solución.

μmol Pi reales:

X=(0,000-0,1381)/8,3976

X=-0,0164 μmol Pi

Por lo tanto los μmol:

Solución N°3

μmol Pi

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