DETERMINACIÓN DEL ORDEN DE LA REACCIÓN DE LA HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

PRACTICA 4

DETERMINACIÓN DEL ORDEN DE LA REACCIÓN DE LA HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

1. INTRODUCCIÓN.

Se conoce el orden de reacción de la hidrólisis de la sacarosa como de seudo primer orden. Para comprobar esto se realizó un ensayo haciendo reaccionar diversas concentraciones de sacarosa con 1ml de HCl 1M por 5 minutos y neutralizándola con 2 ml de NaOH 0.5N. Para determinar las concentraciones de glucosa se empleo la glucosa oxidasa como método indirecto en la formación del complejo cereza por presencia de 4AF y Fenol. Los tubos coloreados fueron medidos en el espectrofotómetro a 505nm y con las absorbancias se pudo construir una curva glucosa vs sacarosa observando similitudes a una curva de primer orden.

2. OBJETIVO.

a. Verificar que la hidrólisis de la sacarosa es de primer orden.

3. FUNDAMENTO TEÓRICO

La sacarosa es un disacárido de glucosa y fructosa. No contiene ningún átomo de carbono anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos de sus dos unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí covalentemente mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la sacarosa no es un azúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor.

La glucosa puede determinarse por métodos químicos pero estos en su mayoría carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos, por lo cual mejor es emplear métodos enzimáticos para la determinación de la misma. Así la glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable.

Esta enzima recibe como nombres también glucosa oxihidrasa, glucosa aerodehidrogenasa, beta-D-glucosa oxidasa entre otros.

Básicamente cataliza la oxidación de D-glucosa a D-glucono-δ-lactona, pero también acciona sobre 2-deoxy-D-glucosa, D-manosa, D-galactosa y D-xilosa, pero de manera mas lenta que en la glucosa.

Es una enzima oxidoreductasa que actúa sobre grupos CH-OH con oxígeno como aceptor. Utiliza FAD (Flavin Adenin Dinucleotido) como cofactor y se encuentra en la ruta metabólica de las pentosas.

Presenta la siguiente reacción química:

beta-D-glucosa + O2 = D-glucono-1,5-lactona + H2O2

Esta reacción se puede explicar por el siguiente esquema:

Donde P1 y P2 son gluconolactona y H2O2 respectivamente, y G es glucosa. Las etapas 2 y 4 son de primer orden.

Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente o mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado

Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina que reacciona con el fenol y el peróxido de hidrógeno en presencia de HRP para formar un colorante con estructura de quinonaimina, que presenta un máximo de absorción a 505 nm.

4. MATERIALES Y REACTIVOS

a. MATERIALES

• Pipetas de 1ml

• Pipetas de 10ml

• Pipetas Pasteur

• Fiola de 100ml

• Bagueta

• Beackers

• Espectrofotómetro

• Tubos de ensayo

b. REACTIVOS

• Solución de Sacarosa 0.8M

• Solución de HCl 1N

• Solución de NaOH 0.5N

• Solución estándar de Glucosa de concentración 100mg/ml)

• Baño Maria

• Agua destilada

• Reactivo de trabajo (Glucosa God-POD)

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

a) PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES: Prepara

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