Determinacion De RNA
Enviado por crojot • 6 de Julio de 2015 • 342 Palabras (2 Páginas) • 215 Visitas
4.1.3.- Extracción de RNA total: Método de Chomczynski
4.1.3.1.- Homogenizado del Tejido
Se procede a pesar la cantidad necesaria de tejido, en este caso se utilizó riñón, se tomaron 50mg de éste, seguido se agregan 0,5mL de la solución de Chomczynski, posteriormente se centrifuga a 12.000rpm por 10min. Finalizada la homogenización se realiza la separación de fases.
4.1.3.2.- Separación de Fases
La muestra obtenida en la homogenización anterior se deja incubar a temperatura ambiente durante 5min. En este paso se puede guardar la muestra a -20°C. Si se utiliza la muestra el mismo día se extraer el sobrenadante y se agrega 01mL de cloroformo, a continuación se agita vigorosamente por 15seg. incubándose la muestra durante por 2-3min. a temperatura ambiente, finalmente se centrifuga la muestra a 12.000rcf por 15min. a 28°C.
4.1.3.3.- Precipitación del RNA
Finalizada la separación de fases se procede a la precipitación del RNA, se debe transferir la fase acuosa superior a un tubo Eppendorf nuevo, se precipita el RNA añadiendo 0.25mL de alcohol isopropílico. Mezclar e incubar por 10min. a -20°C. Seguido se centrifuga la muestra a 12.000rcf por 15min. a 2-8°C, pasado el tiempo se elimina el sobrenadante y se lava el precipitado de RNA con 0,5mL de alcohol etílico al 75%, en esta etapa se retira el sobrenadante quedando solo el precipitado. A continuación la muestra se centrifuga a 7.500rcf por 5min. a 2-8°C. Terminada la centrifugación se elimina el sobrenadante y secar el precipitado al aire por 5-10min. Disolver el RNA en 50μL de agua libre de nucleasa (no se debe resuspender y se debe guardar inmediatamente a -20°C). Finalmente cuantificar por espectrofotómetro (Thermo Electron Corporation GENESYS 6®, USA) a una concentración de 260 ŋm para RNA. Con el propósito de verificar la integridad del RNA extraído y descartar aquellas preparaciones que presentaran degradación y contaminación con proteínas y alcoholes, se procedió a medir a través del biofotómetro (Eppendorf AG®, Biophotometer, Hamburgo, Alemania) con un rango de absorbancia de 260-280ŋm y de 260-230ŋm, respectivamente, al día siguiente.
El RNA obtenido se utilizara con posterioridad para el análisis de Real Time-PCR.
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