Determinación de bilirrubinas en suero sanguíneo

Práctica #3:

DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINAS EN SUERO SANGUÍNEO

1. Temario teórico que apoya:

Metabolismo del grupo hemo.

2. Objetivo:

Cuantificar el contenido de bilirrubinas en suero sanguíneo y dar interpretación diagnóstica del resultado.

3. Marco teórico.

La bilirrubina es un pigmento biliar amarillo rojizo que se encuentra normalmente en el suero como resultado de la destrucción de los eritrocitos. Es un producto de la degradación de la hemoglobina y existe en dos formas. La bilirrubina no conjugada (indirecta) es transportada hacia el hígado fijada a albúmina donde luego es conjugada (directa) con ácido glucorónico y excretada en la bilis, de donde pasa al duodeno para ser eliminada. Las concentraciones de bilirrubina en la sangre pueden subir debido a sobreproducción, disminución de la absorción por parte del hígado, disminución de la conjugación, disminución de la secreción del hígado o bloqueo de las vías biliares.

En caso de aumento de producción, disminución de absorción del hígado o disminución de la conjugación, la bilirrubina no conjugada, denominada bilirrubina indirecta, estará básicamente elevada. En casos de disminución de secreción del hígado u obstrucción de las vías biliares, la bilirrubina conjugada o bilirrubina directa, estará básicamente elevada. Existen una serie de enfermedades heredadas o adquiridas que afectan a la producción, captación, metabolismo y excreción de bilirrubina, resultando en una hiperbilirrubinemia.

Se observa hiperbilirrubinemia no conjugada en recién nacidos (ictericia fisiológica), en un aumento de la destrucción de eritrocitos (anemia hemolítica, hematoma extenso), en eritropoyesis defectuosa así como en algunas enfermedades genéticas poco frecuentes (síndrome de Gilbert, síndrome de Crigler-Najjar).

La hiperbilirrubinemia conjugada se asocia a una disminución en la excreción de bilis debida a enfermedades hepáticas (hepatitis o cirrosis) o bien a una colestasis intra o extrahepática. La ictericia es una manifestación clínica de la hiperbilirrubinemia, que consiste en una deposición de los pigmentos biliares en la piel, originando coloración amarillenta de la piel y mucosas.

Los métodos tradicionales para la determinación de la bilirrubina se basan en la reacción de ésta con el reactivo diazo para formar el compuesto colorido azo-bilirrubina. La bilirrubina directa presente en la muestra reacciona con el ácido sulfanílico diazoado formando azobilirrubina, un complejo coloreado que puede determinarse espectrofotométricamente. La reacción diazo puede acelerarse mediante la adición de varios compuestos químicos, tales como etanol, cafeína o DMSO. Para la determinación de la bilirrubina total se adiciona un tensoactivo como agentes solubilizantes, como es el caso de la cetrimida, la cual solubiliza la bilirrubina indirecta permitiendo su reacción junto con la fracción directa. Los términos “directa” y “total” se refieren a las características de reacción en presencia o ausencia de solubilizantes (aceleradores). La bilirrubina “directa” e “indirecta” equivale sólo de forma aproximada a las fracciones conjugada y no conjugada.

Bilirrubina + Sal de 2,4-diclorofenildiazonio Azobilirrubina

4. Recursos materiales:

Materiales

Material para sangrado:

-8 Tubos tapa roja

-1 torniquete

-8 vacutainer (agujas)

-Guardianes bioseguridad

-Capuchones

-Solución descarte (amonio cuaternario)Tubos de ensayo

-Gradillas

-Tubos de ensayo

-Servilletas

Equipos

-Baño maría

-Micropipetas de 100 µL, 250 µL y 1000 µL

-Espectrofotómetro

-Celdas para espectrofotómetro

Sustancias:

-Suero sanguíneo

Reactivos:

Reactivo para determinar bilirrubina total:

-Reactivo AT Acido sulfanílico 29 mmol/L

Acido clorhídrico 0.2 mmol/L

Cetrimida 50 mmol/L

-Reactivo BT Nitrito sódico 11.6 mmol/L

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