Determinación por fotocolorimetría de proteínas en el suero sanguíneo

 Determinación por fotocolorimetría de proteínas en el suero sanguíneo.

Maria Jose Giraldo Vallejo, Andres Felipe Ocampo

1. Introducción.

Las proteínas son el principal componente de las  estructuras de las células  y  compuesto en los mecanismos de reacción, poseen numerosas funciones dentro del organismo y múltiples características, son sustancias nitrogenadas siendo este contenido en un medio del 16%.  (Gil, 2005). Forman parte integral del protoplasma y núcleo de todas las células y son componentes esenciales del plasma sanguíneo por su alto grado de especificidad en el desempeño de las funciones  primordiales en el mantenimiento de la vida. (Otero, 1950).

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas de unidades de aminoácidos los cuales se unen por enlaces peptídicos entre los grupos carbono y ánimo con pérdida de agua. También tienen importancia nutricional aunque en menor medida. (Gil, 2005).  

Por otra parte la albúmina también llamada proteína globular es una proteína soluble en agua por lo tanto esta se digiere fácilmente, contiene una alta proporción de aminoácidos esenciales,  está presente en la sangre, la clara de huevo, la leche y otras sustancias y su principal objetivo es transportar, mantener el equilibrio y la presión coloidosmótica del plasma. (Guerra, 2020).

Para esta práctica se utilizó como concentración la albúmina que es la proteína plasmática más común y representa aproximadamente el 54.13% del peso neto de las proteínas plasmáticas. Su función es mantener la presión que regula la distribución de líquido corporal entre los compartimientos intravasculares y extravasculares y es responsable de transportar ácidos grasos (Montoya, 2018) 

Para reconocer y determinar la cantidad de proteínas y albúmina que se puede tener en la sangre, cabe destacar que existen varios métodos, por ejemplo. La fotocolorimetría es una técnica distintiva, esta técnica se utiliza con mayor frecuencia en términos cuantitativos y se determina las concentraciones de las sustancias por eso se trabaja aplicando la ley de Beer que cumple con la siguiente ecuación:

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  Ecuación 1. 

Donde A es la Absorbancia, b es la longitud de la celda, ε es la absortividad molar (depende de la sustancia y de la longitud de onda) y C la concentración de la sustancia. La ley de Beer asume una dependencia estrictamente lineal de la absorbancia de la concentración. Por lo general, las interacciones químicas y la imperfección instrumental son responsables de las desviaciones experimentales de esta linealidad. (Mayerhöfer & Popp, 2019).

El método que utilizamos para el aislamiento y la purificación de las proteínas fue la centrifugación, es una técnica que nos permite separar sustancias de tienen diferentes tamaños o masas, ya que presenta diferente velocidad de sedimentación o precipitación cuando se someten a una fuerza centrífuga. (Martin, 1982).

Frente a los resultados cuantitativos de la práctica tenemos la curva de absorción del suero en la zona ultra ultravioleta es la suma de las distintas curvas, cuyo sumando más importante es la curva desnuda a las proteínas, también contribuye en la curva total, la absorción debida a los otros componentes del plasma. (Otero, 1950).

2. Materiales y métodos

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Figura 1. Separación de las globulinas del suero. Elaboración propia

Figura 2. Separación de la solución de proteínas totales. Elaboración propia[pic 4]

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Figura 3. Medición de absorbancia de las soluciones de proteínas. Elaboración propia

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Figura 4. Preparación de la curva de calibración de albúmina. Elaboración propia

3. Resultados y Discusión

En la tabla #1 se presentan los datos obtenidos de la absorbancia de las soluciones.

Tabla 1. Datos de absorbancia de soluciones. Elaboración propia

En la gráfica #1, se presenta la curva de calibración, la cual es útil para el cálculo de concentraciones a partir de un dato de absorbancia o viceversa. Esto es posible gracias a la ecuación de la recta que se genera:

Y= mx + b    Ecuación 2.

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 Gráfico 1. Curva de calibración. Elaboración propia

Esta gráfica además de permitirnos calcular las concentraciones con precisión nos ayuda a determinar los límites de intervalos, que en nuestro tenemos una curva con tendencia lineal por eso dicho intervalo está entre los datos que se ajustaron linealmente, esto quiere decir que se puede determinar la concentración final en el rango anterior con un alto grado de confiabilidad.  

3.1 Separación de las globulinas y proteínas totales del suero

Para lograr la separación de las globulinas de las demás proteínas presentes en el suero sanguíneo fue necesario agregar a la solución de proteínas 5 ml de sulfato de amonio 5.67 M (convertido de su concentración original de 750 g/L) con el fin de reducir la solubilidad de las globulinas para que se precipitan mediante el efecto llamado salting out. lo que ocurre es que cuando se agrega alguna proteína a un medio solo con agua, las moléculas de agua interactúan con la capa hidrofílica de la proteína (usualmente ubicada en la parte superficial), estabilizando y previniendo la agregación entre cada molecula de proteina. Sin embargo cuando se agrega una sal en altas concentraciones (>>0.5 M) (Duong-Ly & Gabelli, 2014), los iones de la sal empiezan a interactuar con las moléculas de agua, dejando a las moléculas de la proteína sin un medio para estabilizarse. Para contrarrestar este efecto, las moléculas de proteína se empiezan a agregar entre ellas en busca de dicho estado estable, causando su precipitación. Debido a que cada proteína tiene una cantidad y variación de aminoácidos diferentes, la concentración de sal requerida para precipitar una determinada proteína varía; mientras algunas son muy solubles en agua, por lo tanto, se requiere una mayor concentración de sal para insolubilizarlas, otras de por sí son bastante menos solubles, por lo que se requerirá menos concentración de sal para precipitarlas (Andrey K, 2015). El uso de sulfato de amonio como agente precipitante se puede explicar mediante 2 formas: una es su bajo costo, facilidad de obtención puro y su alta solubilidad, lo cual ayuda a las soluciones a alcanzar una alta fuerza iónica, y a mayor fuerza iónica, menor será la solubilidad de la proteína (Duong-Ly & Gabelli, 2014). La otra forma de explicar su uso es mediante la serie de Hofmeister, la cual es una “clasificación” de iones según su capacidad para afectar la solubilidad y estabilidad de las proteínas y otros sistemas.

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