ESTERILIZACIÓN POR CALOR

PRÁCTICA 4

ESTERILIZACIÓN POR CALOR

1. INTRODUCCIÓN

Para poder desempeñar correctamente las tareas en un laboratorio de microbiología, es indispensable contar con conocimientos teóricos acerca de los diferentes métodos de control del crecimiento microbiano (métodos de esterilización, desinfección, apepsia, etc.). También con un buen manejo práctico de los aparatos destinados a tal fin, del flameado de tubos y esterilización de ansas y agujas a la llama del mechero.

En microbiología la esterilización se define como “el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el material y medios de cultivo a ser empleados. Existen diversos métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de oxido de etileno (para jeringas y cajas de plástico).

1.1. AGENTE FÍSICO: EL CALOR

El calor es uno de los agentes físicos más usados. Su acción depende de la temperatura alcanzada y del tiempo de aplicación. De la consideración de éstos dos aspectos surgen las siguientes expresiones:

• Punto térmico mortal: es la menor temperatura capaz de matar una suspensión bacteriana en 10 minutos (tiempo constante y temperatura variable).

• Tiempo térmico mortal: es el menor tiempo necesario para matar una suspensión bacteriana a una temperatura determinada (tiempo variable y temperatura constante).

Para medir el efecto del calor se debe tener en cuenta si se trata de formas vegetativas o esporuladas (de resistencia).

Para eliminar las formas vegetativas no se requiere de temperaturas muy altas ya que la mayoría se destruye a los 50 y 70°C, especialmente las patógenas. Las bacterias esporuladas requieren de temperatura superiores a los 100°C.

Además de la temperatura y el tiempo de exposición es importante tener en cuenta la humedad, el pH y la naturaleza del material a esterilizar. La humedad hace más efectivo el poder de penetración del calor; en cuanto al pH, el agregado de ciertas sales alcalinas aumenta la temperatura de ebullición.

Fundamento de la esterilización por calor: El calor actúa desnaturalizando (Coagulando) las proteínas. En las formas esporuladas (de resistencia), esta acción se ve disminuida por la presencia de lípidos formando parte de su estructura química, que actúa protegiendo las uniones peptídicas de las proteínas.

1.2. FORMAS POSIBLES DE LA UTILIZACIÓN DEL CALOR COMO AGENTE ESTERILIZANTE

El calor puede ser aplicado para la esterilización de tres maneras diferentes:

1.2.1. Calor Seco. Es aire a temperatura elevada. Existen tres tipos:

a) Fuego directo: Consiste en exponer directamente a la llama el material a esterilizar, lo que se logra por oxidación violenta. Este método se utiliza para ansas, agujas, flameado de bocas de tubos u otros recipientes y destrucción de material contaminado. En las llamas de los mecheros Bunsen se alcanzan temperaturas superiores a los 2.500°C, por lo que una breve exposición es suficiente. Sin embargo, cuando las ansas de siembra están muy cargadas con microorganismos, la aplicación directa de la llama provoca la dispersión irregular del contenido de aquéllas, con el consiguiente peligro de la contaminación. Un sistema alternativo a los mecheros son los incineradores eléctricos bacterianos, en los que el riesgo de contaminación no existe., ya que la dispersión es recogida en el tubo del aparato.

b) Incineración en hornos crematorios: Se aplica a elementos contaminados de los que no importa su destrucción, como apósitos, cadáveres de animales infectados o material plástico contaminado. Se utiliza la combustión directa o el horno crematorio.

c) Aire caliente (ej. Horno Pasteur): Se emplean las estufas de calor seco (ver Figura 1), en las que el aire caliente circula por el espacio que existe entre la doble pared, transmitiendo así el calor a los objetos que se encuentran en su interior. Los microorganismos se mueren por oxidación de sus estructuras previa deshidratación, pudiéndose llegar a una ligera carbonización.

Tiempo requerido: Una hora y media a dos horas, a una temperatura de 160 a 180ºC. El tiempo se mide desde el momento en que se alcanzó la temperatura indicada y está condicionado por la cantidad de material y su distribución dentro de la estufa. El aire caliente no tiene mucho poder de penetración, por esta razón es que se requiere mayor temperatura y tiempo que con otros métodos.

Aplicación: se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio. Recordar que todo el material debe ir perfectamente acondicionado, preferentemente envuelto en papel blanco de modo tal que una vez retirado de la estufa, permanezca estéril hasta el momento de ser usado.

Descripción de la estufa: La estufa de esterilización a seco es una caja metálica de paredes triples. La pared interior es generalmente de acero inoxidable y presenta orificios para la libre circulación del aire caliente. La pared intermedia encierra, junto con la externa, el material aislante, que puede ser lana de vidrio o amianto. La fuente de calor es una resistencia eléctrica aunque también existen estufas a gas. Viene provista de un termorregulador para graduar la temperatura deseada.

En la cara superior de la estufa existen orificios para permitir la salida de gases y vapores, pudiendo existir otro para la colocación de un termómetro en caso de no traerlo incorporado.

En el interior posee rejillas metálicas de altura graduable para acondicionar sobre ellas el material a esterilizar.

Uso: esterilización de material de vidrio y otros materiales termorresistentes que interese mantenerlos secos. Todo el material a esterilizar debe estar debidamente empaquetado con papel de estraza o contenido dentro de cajas metálicas.

1.2.2. Calor Húmedo. El vapor de agua es uno de los métodos más eficaces para destruir microorganismos y, a igualdad de temperatura, es mucho más eficaz que el calor seco (aire). Hay varias formas de emplear el calor húmedo.

a) Agua a ebullición: Se colocan los objetos en el agua y se lleva a ebullición durante un tiempo no menor de quince minutos. Se utiliza para jeringas, agujas, ampollas, etc. Precaución: Los gérmenes esporulados y ciertos virus no mueren con 15 minutos de ebullición.

b) Vapor fluente: Consiste en colocar el material en el autoclave pero con la espita abierta (ver Figura 2). Se utiliza para esterilizar sustancias que se descomponen por encima de los 100 ºC. Ejemplos: medios de cultivo que contienen ciertos glúcidos, leche, antibióticos, etc. Este método puede complementarse con la Tyndalización (se explica más adelante).

c) Vapor a presión: Es uno de los métodos más utilizados; se emplea el autoclave para esterilizar material en general y particularmente para medios de cultivo y otros compuestos químicos utilizados en el laboratorio de microbiología.

Este método tiene gran poder de penetración, razón por la cual la esterilización se puede llevar a cabo a menor temperatura y tiempo que cuando se emplea la estufa (calor seco) y está especialmente recomendado para la eliminación de formas esporuladas.

Descripción del autoclave:

El autoclave consiste en un cilindro de bronce, horizontal o vertical, con una tapa del mismo material que se apoya sobre una arandela de goma y se cierra por pestillos o cerrojos quedando herméticamente cerrado. Además, posee en la parte superior una llave de vapor (o espita), un manómetro y una válvula de seguridad.

En el interior del autoclave se coloca un volumen de agua que se hace hervir, ya sea por medio de quemadores externos que se encuentran en la parte inferior del aparato, o mediante calentadores eléctricos de inmersión.

Se cierra luego la tapa, se atornilla dejando abierta la espita hasta que todo el aire del interior haya sido desplazado por el vapor. Debe dejarse que el vapor salga por la espita unos 5 minutos antes de cerrarla.

Es muy importante que la eliminación del aire ya que, de lo contrario, la presión marcada por el manómetro indicará la temperatura a la que se encuentra la mezcla vapor aire en el interior, que es menor a la esperada para el vapor saturado a esa presión.

Una vez que se ha cerrado la llave de vapor (espita), comienza a elevarse la presión en el interior del autoclave; usualmente se fija la válvula de seguridad para que se abra a 15 libras/pulgada2, estas presiones corresponden a 115 y 121ºC.

Presión (Libras/pulg.2) Temperatura (ºC)

5 107

7 110

10 115

15 121

20 126

Fuente: Universidad Nacional del Comahue, 2007.

Los equipos autoclaves son probados por los fabricantes hasta presiones de 60 libras/pulg.2 o más, pero para mayor seguridad puede fijarse una virola sobre la válvula de seguridad para que no pueda ser desplazada accidentalmente, pudiendo alcanzarse una presión mayor que la necesaria.

Cuando el manómetro indica que se ha alcanzado la presión deseada, se disminuye la entrada de gas, y así la llama del mechero, ya que el calor necesario para mantener la presión es menor que el requerido para alcanzarla.

La presión se mantiene durante unos 20 minutos momento en que se cierra el paso del gas. No deben abrirse ni el autoclave ni la espita hasta que el manómetro indique “0” (cero). Si la presión se libera violentamente los líquidos en el interior del aparato hierven tumultuosamente, pudiendo

...