EXPRESION Y PURIFICAION

RESUMEN

Las proteasas se encuentran en todos los organismos vivos desempeñando un papel importante en múltiples procesos biológicos y fisiológicos, entre ellos la digestión de los alimentos, metamorfosis, cicatrización de heridas, patogénesis, eliminación de células patógenas y coagulación de la sangre para evitar su pérdida [1]. Las funciones de las reacciones de las proteasas en los organismos son benéficas, sin embargo, pueden llegar a ser perjudiciales al no controlarse debidamente; por lo tanto, los diversos procesos de las proteasas son regulados por los inhibidores específicos para prevenir efectos nocivos en células y organismos [2].

Durante el estudio de la familia de inhibidores proteicos de serina proteasas tipo kazal, se han podido identificar moléculas de este prototipo en protozoos pertenecientes al grupo de los Apicomplexa, como, Toxoplasma gondii, Neospora caninum y Eimeria tenella. En Toxoplasma gondii, se observaron dos inhibidores con cuatro (4) secuencias kazal; una de ellas, denominada TgPI-1, el cual tiene cuatro (4) regiones altamente homologas con inhibidores kazal no clásicos. En estudios preliminares, la proteína recombinante rTgPI-1 mostró ser un potente inhibidor de tripsina, quimotripsina, trombina, elastasa pancreática y neutrófila. Posteriormente, TgPI-1 fue propuesto como un nuevo antígeno para el desarrollo de vacunas de subunidades contra T. gondii porque demostró ser altamente inmunogénico y preventivo en ensayos de inmunización en ratones [3]. Por otra parte, varios inhibidores tipo kazal están implicados en la respuesta al ataque de bacterias, pues estos inhibidores han señalado tener acción bacteriostática en ensayos in vitro; por lo que se planteó en este estudio evaluar si el inhibidor rTgPI-1 era capaz de interferir con el crecimiento de bacterias que infectan regularmente las plantas, por ende fue necesario expresar la secuencia que codifica el inhibidor utilizando el vector pQE30 en la cepa bacteriana de E. coli M15 para su posterior purificación por cromatografía de afinidad en columna de níquel; debido a que el vector presenta una secuencia que codifica una cola de histidinas que queda adherida al N – terminal de la proteína recombinante después de la expresión, facilitando su separación sin desnaturalización. La proteína purificada fue identificada mediante western blot con un anticuerpo policlonal.

Con base en la prueba de purificación descrita anteriormente se efectuaron los respectivos ensayos de actividad bacteriostática y unión a microorgánismos frente a bacterias que normalmente infectan plantas como las Pseudomonas syringae y viridiflava. Los resultados obtenidos permitieron evidenciar que rTgPI-1 tiene actividad bacteriostática puesto que inhibe el crecimiento del microorgánismo patógeno en un porcentaje superior al 50 % en ensayos in vitro mediante una unión

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