El análisis del transcriptoma de Escherichia coli O157

El análisis del transcriptoma de Escherichia coli O157: H7 cultiva in vitro en el contenido cecal estéril filtrado del intestino humano microbiota asociada ratas revela una expresión de adaptación de los genes metabólicos y de virulencia

• Guillaume Le Bihan una,
• Grégory Jubelin b,, , 
• Philippe Garneau una,
• Annick Bernalier-Donadille b,
• Christine Martin b,
• Francis Beaudry c,
• Josée Harel una,, 

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doi: 10.1016 / j.micinf.2014.09.008

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Abstracto

En los países desarrollados, enterohemorrágica Escherichia coli (EHEC) O157: H7 es una causa principal de diarrea con sangre y fallas renales en humanos. La comprensión de las estrategias empleadas por ECEH de colonizar el intestino es de gran importancia, ya que hasta el momento no existe cura para erradicar el patógeno. En este estudio, se examinó la respuesta adaptativa de EHEC al medio intestinal condicionado por una microbiota humana. Un análisis transcriptómica se realizó en la cepa EHEC EDL933 se incubaron in vitro en el contenido cecal estéril filtrada de ratas microbiota asociada humanos (HMC) en comparación con EDL933 se incubaron en el contenido cecal estéril filtrada de rata libre de gérmenes (GFC). EDL933 cambia de un perfil metabólico glucolítico en el GFC a un perfil metabólico anaplerótico en HMC. La expresión de varios genes del catabolismo se vio fuertemente afectada tales como los implicados en la utilización de azúcares, glicerol, ácido N-acetilneuramínico, aminoácidos y metabolitos secundarios. Curiosamente, el nivel de expresión de crítica ECEH O157: H7 genes de virulencia incluyendo genes del locus de enterocito effacement se redujo en HMC. En conjunto, estos resultados contribuyen a la comprensión de EHEC respuesta adaptativa a un contenido digestivo y ponen de manifiesto la capacidad de la microbiota para reprimir la expresión de genes de virulencia EHEC.

1. Introducción

Enterohemorrágica Escherichia coli (EHEC) O157: H7 es un patógeno de transmisión alimentaria humana que es frecuentemente responsable de los brotes infecciosos en los países desarrollados. Infecciones de EHEC pueden conducir a la colitis hemorrágica y el hemolítica en peligro la vida y el síndrome urémico. En los seres humanos, EHEC O157: H7 se dirige el epitelio del intestino grueso. Allí, se produce adhesión y borrado lesiones (lesiones AE) que se caracterizan por un archivo adjunto íntima de las bacterias a las células epiteliales y la formación de una estructura de pedestal. Entre la amplia gama de genes de virulencia de EHEC, el locus de enterocito effacement (LEE) se compone de cinco operones que codifican para un sistema de secreción de tipo III (T3SS) y tipo III secretada (T3S) efectores, ambos necesarios para la formación de lesiones AE y dañar el epitelio del colon [1]. AE lesiones implican los genes LEE EAE y tir de codificación, respectivamente, para la adhesina de EAE y su receptor específico Tir T3S, se inyecta en la célula huésped [1]. Además, numerosos genes se distribuyen en islas de patogenicidad, distinta de la LEE, que codifican para T3S efectores críticos para la patogenicidad EHEC [2]. Sin embargo, los síntomas más graves de infección por EHEC depende de la producción de la toxina Shiga (Stx), un AB 5 toxina que se asocia con el desarrollo de síndrome hemolítico urémico y [1].

La microbiota intestinal es un consorcio simbiótico compleja de cientos de especies de bacterias que contribuyen a la homeostasis intestinal y anfitrión de la salud, y que actúa como una barrera para evitar la proliferación de patógenos entéricos, un fenómeno conocido como resistencia a la colonización [3]  y  [4]. Fuerzas ecológicas que dieron forma a la microbiota intestinal llevó a la aparición de especies de bacterias que han desarrollado mecanismos específicos para explotar eficientemente los nutrientes disponibles [3], [5]  y  [6]. Por lo tanto, los patógenos entrantes necesitan desarrollar estrategias para adaptarse a la presencia de la microbiota. Uso in vitro bovina pequeño contenido intestinal, hemos demostrado que la cepa EHEC EDL933 es capaz de catabolizar simultáneamente varios azúcares derivados de moco [7]. Del mismo modo, la fuente de nitrógeno importante, etanolamina liberado de fosfolípido incluido en animales, vegetales y las membranas celulares microbianas, favorece EDL933 persistencia en el intestino delgado bovino [8]. In vivo investigaciones de la nutrición de carbono de EDL933 han demostrado que los sustratos gluconeogénicos son importantes para la colonización intestinal del agente patógeno, especialmente durante la competencia con comensal E. coli [9]. La capacidad de EHEC para adaptarse a la disponibilidad de nutrientes y las condiciones ambientales es la clave para su tiempo de residencia y la supervivencia.

La capacidad de adhesión y borrado patógenos (patógenos AE) para adherirse íntimamente a las células epiteliales intestinales se basa en la expresión de los genes LEE [5]. Como un patógeno AE, EHEC O157: H7 ha adquirido mecanismos para percibir el ambiente que conduce a la adecuada regulación de genes LEE [10]. Desde una gama de compuestos intestinales afecta a la expresión de los genes de virulencia de EHEC O157: H7 [11] y que la microbiota intestinal influye en gran medida sobre el metaboloma intestinal [12], la expresión de genes de virulencia de EHEC en el contenido intestinal de mamífero necesita ser investigado .

Microbiota humana ratas asociados se utilizan con frecuencia como un modelo para estudiar las interacciones microbio de acogida [13]. Para descifrar las formas que garanticen la adaptación ECEH a un ambiente intestinal, se investigó el transcriptoma de ECEH EDL933 crecido in vitro en un h umanos m de rata asociada icrobiota c contenidos ECAL (HMC) y en un g ERM- f ree de rata c contenidos ECAL ( GFC). Nuestros resultados pusieron de relieve un interruptor metabólico claro a partir de un glucolítica a un perfil de anaplerotic, después de que el crecimiento de EHEC EDL933 en HMC, así como una inhibición de la expresión de un gran número de genes de virulencia implicados en la formación de la lesión AE. Estos resultados contribuyen a entender cómo un patógeno como EHEC se adapta a un ambiente intestinal a través de la coordinación de reorganización transcriptoma. Además, nuestros datos también destacan la capacidad de la microbiota intestinal para reprimir la expresión de genes de virulencia EHEC, un mecanismo que contribuye a la colonización resistencia.

2. Material y métodos

2.1. Declaración de Ética

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directivas europeas en materia de protección de los animales utilizados para fines científicos de 2010/63 / UE, y el laboratorio está obligado a las directrices del comité de ética local CEMEAA 02. El protocolo (número de registro CE 120- 02) fue aprobado por el comité local de ética CEMEA Auvernia.

2.2. Procesamiento de la muestra fecal

Las muestras de heces de un voluntario adulto sano se utilizaron en este estudio. El sujeto se consume una dieta occidental estándar, no recibió antibióticos durante los tres meses anteriores al estudio y tenía enfermedad gastrointestinal diagnosticados no anterior. Recién heces evacuadas fueron almacenadas a 4 ° C en condiciones anaerobias y procesados ​​dentro de 12 h. Un gramo de muestra fecal recogida se diluyó 10 veces (peso húmedo / volumen) en una solución mineral anaeróbico que contiene 5 g / l NaCl, 2 g / l de glucosa y 0,3 g / l cisteína-HCl.

2.3. Ratas libres de gérmenes y intestino humano microbiota trasplante

Se utilizó un modelo validado de ratas libres de gérmenes trasplantados por una microbiota intestinal humana como se describió anteriormente [13], [14], [15]  y  [16]. En pocas palabras, diez libre de gérmenes adultos masculinos Fisher 344 ratas, sin alteraciones funcionales y proporcionados por las instalaciones de cría de la plataforma Anaxem del INRA (Unidad Micalis, Jouy-en-Josas, Francia) fueron mantenidos en aisladores libres de gérmenes con luz controlada, temperatura y humedad y se alimenta con comida esterilizada y agua. Para reproducir la diversidad de una dieta de tipo humano, la comida contenía los lípidos y las proteínas de origen animal y vegetal, sacarosa y almidón cocido. Los diez ratas fueron separados aleatoriamente en 2 grupos de 5 personas.

Trasplante de microbiota fecal humana en los intestinos de rata se realizó como se ha descrito previamente [14], [15]  y  [16]. Un primer grupo se inoculó con 1 ml de una dilución fresca (10 -3) de una microbiota fecal de un voluntario sano y una segunda se inoculó con 1 ml de solución mineral anaeróbico y se utiliza como una referencia. Las ratas fueron criados por dos semanas y se sacrificaron por CO 2 inhalación. Los contenidos cecales de cada grupo se recogieron, se reunieron y se centrifugaron durante 30 min a 7000 × g. Los sobrenadantes fueron esterilizadas por filtración (0,2 micras), filtrados se diluyeron en una solución de medio mineral y la glucosa se ​​añadió a una concentración final de 0,2%;pH se ajustó a 7 mediante la adición de 10 N NaOH. El in vitro microbiota humana asociada de rata contenido cecal o contenido cecal libre de gérmenes de la rata, llamada HMC y GFC, respectivamente, fueron utilizados como medios de cultivo para la cepa EDL933 ECEH.

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