Tp 1 extracción de adn cromosómico de escherichia coli
Enviado por canderot • 3 de Septiembre de 2015 • Informes • 1.161 Palabras (5 Páginas) • 719 Visitas
TRABAJO PRÁCTICO N° 1: Extracción de ADN cromosómico de Escherichia Coli
- Introducción
La Escherichia Coli es una bacteria. Las bacterias son organismos procariotas, es decir, que no tienen un núcleo celular organizado sino que poseen su material genético disperso en el citoplasma. Además de esa característica, el ADN es circular, se encuentra desnudo y puede estar asociado a alguna proteína.
La E. coli es Gram negativa, esto quiere decir que no se tiñen o lo hacen pero quedan de un color rosa suave al someterlas a la tinción Gram. En contraposición existen las bacterias Gram positivas que se tiñen de un color rosa o violeta oscuro. Esta diferenciación tiene que ver con la organización de la envoltura bacteriana. Las Gram negativas presentan dos membranas lipídicas entra las cuales se encuentra una pared celular de peptidoglucano; mientras que las Gram positivas presenta sólo una membrana lipídica y, por otro lado, la pared de peptidoglucano es mucho más gruesa. Entonces, al tener una pared celular fina, las bacterias Gram negativas no retienen colorante durante la tinción.
- Objetivos
Extracción de la mayor cantidad posible de ADN bacteriano lo más puro posible (con la menor cantidad de proteínas y restos celulares).
Comprender el rol que cumple cada uno de las sustancias agregadas para la separación del ADN de los demás compuestos y estructuras que componen a las células procariotas.
- Desarrollo
Para la extracción de ADN cromosómico utilizamos el método de precipitación salina a través de los siguientes pasos:
A. Lisis celular: tenemos cultivo de bacterias centrifugadas en un pellet en medio rico de Tris-HCl y sacarosa 40 ml de E.coli, al que se le agregan 800 µl de EDTA manteniendo el pH 8 y se agita suavemente con la varilla durante 10 minutos.
Seguidamente se agregan 900 µl de Lisozima, se mezcla suavemente con la varilla nuevamente y se la deja reposar 10 min, este paso se hace a temperatura ambiente para que la enzima actúa con mayor eficacia. Luego son agregados 900 µl de tritón y se agita lentamente, pero esta vez se deja que la solución repose 30 minutos.
B. Precipitación del ADN: ahora se agregan 400 µl de Acetato de Sodio y se mezcla. Luego todo se pasa a un vaso de precipitado al que le son añadidos 10 µl de etanol 96%, y se remueve lentamente con la varilla hasta que precipite el ADN.
C. Lavado de sales: Se le agrega etanol 70% para lavar sales posibles que quedasen en solución. Pasado unos instantes se obtiene el ADN enrollado en la varilla.
- Resultados
Al realizar todos los pasos listados obtuvimos un precipitado de color blanco de consistencia viscosa sumergido en un líquido turbio conteniendo residuos celulares. Al enrollarlo en una varilla, pudimos obtener el ADN cromosómico aislado. El ADN obtenido finalmente era blanco, filamentoso y viscoso.
- Conclusiones y discusión
Pudimos concluir que el método de precipitación salina fue exitoso para cumplir nuestro objetivo. Además pudimos ver y comprobar la eficacia de cada una de las sustancias agregadas permitiéndonos comprender la importancia de todos estos pasos.
Por otro lado, al comparar con otros grupos vimos que los ADN cromosómicos obtenidos tenían distintas consistencias algunos presentándose más fraccionado y difícil de enrollar en la varilla, más deshilachados. Esto puede deberse a que se mezcló muy rápidamente, muy fuerte o con la punta más filosa de la varilla.
Discutimos también que el precipitado obtenido no es 100% puro probablemente y que la aparición o ausencia de proteínas y otros restos no puede comprobarse mediante el método que utilizamos. Los contaminantes posibles son: ARN, sales, ADN plasmídico, π.
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