El análisis espectrofotométrico

1. OBJETIVOS

Determinar espectrofotométricamente la concentración de las proteínas del lactosuero.

2. INTRODUCCIÓN

Una técnica empleada en el laboratorio para determinar sustancias es el análisis espectrofotométrico. El método se basa en el hecho de que al pasar un haz de luz blanca a través de una solución coloreada, el complejo responsable del color absorbe algunas longitudes de onda de manera selectiva. Muchos compuestos que son incoloros, forman complejos coloreados que se pueden determinar espectrofotométricamente.

El análisis espectrofotométrico tiene varias ventajas:

1. No se requiere aislar el compuesto a determinar, por ejemplo en fluidos biológicos como en sangre, orina, etc., es decir, se puede efectuar determinaciones sin necesidad de tratamientos previos.

2. El método es específico debido a que cada sustancia en condiciones definidas absorbe en una longitud de onda determinada y de acuerdo con su concentración, es sensible ya que permite medir concentraciones del orden de milimol/L.

Ley de Beer y Lambert

En un experimento de espectrofotometría un haz de luz se hace pasar a través de un monocromador (prisma, red o filtro) para seleccionar una longitud de onda. La luz de una sola longitud de onda llamada monocromática o sea de “un color” incide sobre la muestra, como lo indica la figura 1. Cuando el haz de luz sale de la muestra se puede medir cual es el % de absorción de luz que realizo la muestra.

Figura 1. Diagrama esquemático de un ensayo de espectrofotometría.

La medida de absorción de luz se hace en absorbancia A cuyo valor es directamente proporcional a la concentración c de la especie que absorbe esa longitud de onda en la muestra. La fórmula que representa el fenómeno se conoce como la ley de Lambert- Beer (ecuación 1).

En la ecuación 1 la absorbancia es adimensional y se refiere a la absorción de luz monocromática que realiza el analito coloreado, c es la concentración de analito en unidades de mol/L (M), la constate de celda b se expresa en centímetros y Ɛ es la absortividad molar o coeficiente de extinción que es característico de la sustancia e indica cuanta luz absorbe un analito a una longitud de onda determinada.

La ley de Beer afirma que la absorbancia es proporcional a la concentración de la especie absorbente. Esta ley funciona bien en soluciones diluidas (≤0,01M) de la mayoría de las sustancias.

Para determinar concentración de un compuesto por espectrofotometría, este debe absorber luz y la absorción debe ser diferente a las de otras sustancias presentes en la muestra.

Para establecer la concentración de proteínas se usa el reactivo de Biuret que se forma por la condensación de dos moléculas de urea, eliminado amoniaco en una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) (figura 2).

Figura 2 Condensación de dos moléculas de urea

Sí se añade a una proteína figura 3 se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 540 nm.

Figura 3. Reacción del Biuret con las proteínas

Las características más importantes de la reacción son: Biuret se usa para determinar proteína si la estructura es un tetrapéptido y a todas las proteínas; el rango de determinación es de 1 a 6 mg/mL; no depende de la composición de aminoácidos; algunos compuestos derivados de sales de amonio cuaternarias dan reacción coloreada.

El equipo que se usará en la práctica es un espectrofotómetro Thermo de doble haz, lo que significa que puede colocar en un canal una muestra como blanco y en el otro canal colocar las muestras para leer la curva de calibración y la muestra problema.

Si se cumple la ley de Beer – Lambert y la longitud de onda se conserva constante, al graficar A en función de c se obtiene una recta que pasa por el origen; cuando se grafica en porcentaje de transmitancia en función de concentración resulta una curva negativa exponencial.

Generalmente los espectrofotómetros tienen dos escalas, una lineal de porcentaje de transmitancia y otra logarítmica de absorbancia.

3. CUESTIONARIO PARA EL PREINFORME

Elabore el pre informe, según lo pre-establecido y que contenga los resultados de la siguiente consulta máximo en dos páginas:

Cual es el promedio de concentración de proteína en las muestras a analizar, consultada en tablas de composición nutricional de alimentos?.

Por qué se necesita una curva de calibración para la aplicación de la espectrofometría?

Como se realizará la curva de calibración en la práctica?.

Cuáles son

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