Electroforesis en gel de poliacrilamida
Enviado por Juan Luis MG • 19 de Octubre de 2015 • Prácticas o problemas • 719 Palabras (3 Páginas) • 648 Visitas
Práctica No. 5: Electroforesis en gel de poliacrilamida
Nombre: __________________________________________
Objetivo: Que el alumno comprenda el fundamento teórico de la técnica de electroforesis y determine el peso molecular de una muestra desconocida.
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los métodos mas utilizados para la purificación, análisis y caracterización de proteínas. La técnica permite separar moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un campo eléctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), caotropos (p.e. urea) y agentes diferentes métodos de tinción, siendo el mas habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separación es función del tamaño (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las proteínas. Para ello se compara la movilidad electroforética (Rf) de la proteína de peso molecular desconocido con el de proteínas de referencias de peso molecular conocido.
La SDS-PAGE se utiliza para determinar el peso molecular de proteínas. Para ello se compara el Rf de la proteína problema con el de proteínas de referencia cuyo peso molecular se conoce. Recordemos que el Rf es el parámetro experimental asociado a esta técnica y se define como:
[pic 1]
El frente del gel se determina por la posición de un compuesto de referencia de movilidad máxima, como puede ser el colorante azul de bromofenol.
Fundamento: Realice un ensayo donde explique la determinación del peso molecular de una sustancia por medio de la electroforesis.
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Metodología
I.- Preparación del gel separador al 13%
1.- Mezcla en un matraz lo siguiente en el orden que se indica:
a) Gel separador al 13% de acrilamida en amortiguador Tris-HCl 0.375 M, pH 8.8
Reactivo | 10 mL (g) |
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 | 2.5 mL |
SDS 10% | 0.1 mL |
Acrilamida/bisacrilamida 30% | 4.3 mL |
APS 10% | 0.05 mL |
TEMED | 0.005 mL |
Agua destilada | 3.0 mL |
2.- Con una pipeta Pasteur añade la mezcla anterior al molde hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma que quede suficiente espacio para el gel concentrador.
3.- Con una pipeta limpia cubre la superficie del gel con agua destilada para prevenir el contacto del oxígeno con el gel.
II. Preparación de gel concentrador
1.- Elimina el agua que cubre el gel separador y lava la parte superior del gel 2-3 veces con agua destilada para eliminar cualquier residuo de acrilamida no polimerizada.
2.- Mezcla en un matraz los componentes en el orden indicado:
b) Gel concentrador al 3% de acrilamida en amortiguador Tris-HCl 0.125 M pH 6.8
Reactivo | 10 mL (g) |
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 | 2.5 mL |
SDS 10% | 0.1 mL |
Acrilamida/bisacrilamida 30% | 1.0 mL |
APS 10% | 0.1 mL |
TEMED | 0.005 mL |
Agua destilada | 6.2 mL |
Nota: La polimerización comienza al adicionar el TEMED, por lo tanto se debe trabajar con rapidez a partir de este momento.
3.- Utilizando una pipeta Pasteur, coloca la solución sobre la superficie del gel separador. Inmediatamente inserta el peine en la solución concentradora con cuidado para evitar que se forme burbujas de aire.
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