ELECTROFORESIS DEL ADN EN GELES DE AGAROSA

ELECTROFORESIS DEL ADN EN GELES DE AGAROSA

La concentración e integridad del ADN extraído, así como el tamaño de distintos

fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante

electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de

moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa,

acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo

eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el

grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro,

haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis.

La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son

reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado

durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor

tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la

concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel,

permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento

del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.

Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción

con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración

mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes

fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido

nucleíco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin

embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser

manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes

alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados

específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.

La técnica para la cuantificación de ADN consiste simplemente en la utilización de una

secuencia de concentraciones de solución patrón de ADN con la que se comparan muestras de

ADN de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se hace bajo la luz

ultravioleta según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición prolongada a la luz ultravioleta,

incluso con máscara de protección. La estimación de las concentraciones de ADN puede realizarse

sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de

imágenes. La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del ADN total 2

Protocolos de laboratorio UEG 2009 por:Duina Posso Duque

(proveniente de una extracción de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a

voltajes de 60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante con

geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de

de 100pb a 500pb (los microsatélites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede

variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajes

elevados más rápido corren las muestras.

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