Enzimologia

Introducción:

Para obtener proteínas intracelulares de los microorganismos existen tres métodos generales; enzimáticos, químicos o físicos. No todas las metodologías pueden ser utilizadas en procesos a gran escala. Quizás el ejemplo más destacado es la sonicación, que es el método más empleado en la obtención de proteínas en el laboratorio.

Si hablamos de extracción en general de microorganismos de tejidos vegetales y animales, las células se pueden desintegrar por frotamiento, agitación, ultrasonidos, etc. en un medio extractor, que es una solución salina tamponada, con fuerza iónica y pH adecuados .El producto desintegrado se centrifuga para separar los residuos celulares, para separar las proteínas que interesan (enzimas), la mezcla extraída se fracciona por alguno de los métodos que se revisan a continuación.

1. -Extracción por métodos químicos.

1.1.-Alcalis:

Este método es muy utilizado en extracciones a gran como a pequeña escala. Por ejemplo Wade en 1968 aisló la enzima L-asparraginasa, con utilidades terapéuticas, sometiendo a las bacterias a un pH alcalino, entre 11 y 12.5 durante 20 minutos. Salton en 1964 utilizó álcalis en la preparación de paredes celulares de plantas, hongos y bacterias, comprobando que cuanto mayor era el grado de hidrólisis mas componentes de la membrana se liberaban, entre ellos el citocromo. La técnica depende esencialmente de la estabilidad el enzima en un pH elevado. Este método también inactiva las proteasas que pudieran existir, a la vez se reduce la posibilidad de contaminación por pirógenos de las preparaciones de enzimas para usos terapéuticos. Tales métodos tienen posibles aplicaciones para la inactivación y lisis rápida de los microorganismos modificados por ingeniería genética.

1.2. Lisozima y EDTA

Se le denomina también como método enzimático La lisozima es un enzima producida comercialmente a partir de la clara de huevo de gallina que cataliza específicamente la hidrólisis de los enlaces β-1-4-glicosídicos de los mucopéptidos de las paredes de las células bacterianas. Las bacterias Gram-positivas, en las que el mucopéptido está más extendido les da más rigidez a comparación con las Gram-negativas, son más susceptibles a la lisozima que estas utilizan.

La ruptura final de la envoltura celular depende de la presión osmótica del medio de suspensión una vez rota la pared celular. En las bacterias Gram-negaticas la ruptura de la pared celular se logra rara vez con lisozima, sino que hace falta añadir EDTA para producir la liberación de lipopolisacáridos de la envoltura. Se ha indicado el EDTA actúa quelando los cationes divalentes, esenciales para la estabilidad de la pared, lo que hace que la lisozima pueda acceder y actuar en la capa del mucopeptido (Edward y Noller 1964)

Esta técnica rara vez se utiliza para la extracción a gran escala de los enzimas bacterianos, dado el costo relativamente elevado de la lisozima., aunque éste sea pequeño comparado con una enzima purificada. La clara del huevo de gallina sin procesar es mucho más barata y a menudo igualmente efectiva.

La lisis de la célula con lisozima es un método suave, y puede ser el mejor cuando el enzima a purificar es sensible a las elevaciones de temperatura que se producen durante los procedimientos físicos de lisis, habiéndose utilizado recientemente en la lisis de Pseudomonas fluorescens.

1.3. Detergentes:

Los detergentes pueden ser compuestos iónicos, por ejemplo el lauril sulfato sódico, aniónico, y el bromuro se cetildietilamonio, cationico, o no iónicos, como los distintos tipos de Tween y de Triton. En condiciones de fuerza iónica baja y pH apropiado, los detergentes se combinas con las lipoproteínas formando micelas (Morton, 1955). Por tanto los constituyentes lipoprotéicos de las membranas biológicas pueden solubilizarse o las membranas hacerse permeables. Aun no se conoce en su totalidad el mecanismo de formación del complejo detergente-lipoproteina pero se cree que en el intervienen fuerzas electrostáticas,(puentes salinos) y fuerzas de Van del Waals (Klevens.1950). La formación de estos complejos depende críticamente del pH y de la temperatura.

Los detergentes iónicos son más reactivos que los no iónicos y pueden dar lugar a la disociación de las lipoproteínas, lo que a su vez conduce posteriormente a la desnaturalización, precipitación y ocasionalmente, a la hidrólisis de enlaces peptídicos de las proteínas. Por esa razón los detergentes no son ideales para la extracción de enzimas, Además la precipitación salina de algunas proteínas es más difícil en presencia de detergentes sin embargo estos defectos pueden superarse en muchos casos utilizando la cromatografía de intercambio iónico.(Tzagoloff y Penefsky, 1971).

Con todo, los detergentes se utilizan considerablemente en algunos procesos de extracción. Morris y Darlow (1971) indicaron su utilidad en el fraccionamiento de partículas víricas: el Triton-X 100 se ha utilizado para la liberación a gran escala de la colesterol oxidasa a partir de Nocardia sp. (Buckland el al 1974) y el colato de sodio se ha utilizado para solubilizar la pululanasa, en enzima ligado a las membranas, a partir de células intactas de Klesie pneumoniae.

1.4 Shock por enfriamiento

Este shock consiste en una reducción rápida de la temperatura desde la normal de crecimiento a 0ºC, fue observada por primera vez por Sherman y Albus (1923). La bibliografía al respecto indica que las bacterias Gram-negativas son más sensibles a este proceso. El efecto tiene lugar solamente bajo ciertas condiciones especiales. Da lugar a una pérdida de de viabilidad y libera al medio un producto enzimático que adsorbe a 260nm,aminoacidos y ATP.(Strange 1964).

A gran escala este método es difícil de usar ya que el choque frio tiene un efecto casi nulo en suspensiones celulares con una densidad superior a 108 /ml además las bacterias son mas considerables para el shock cuando se encuentran en fase de crecimiento exponencial. El proceso a gran escala y los equipos tan sofisticado que necesita no lo hacen viable.

1.5 Shock osmótico

El Shock osmótico se ha utilizado en la extracción de enzimas hidrolíticos y proteínasligadoras a partir de bacterias Gram-negativas como por ejemplo Salmonella typhimurium y E coli (Heppel 1967). El método incluye el lavado de las bacterias con una solución tamponada, para liberarlas del medio de cultivo y posteriormente su introducción en una solución tamponada de sacarosa

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