Practico de enzimologia

                    Introducción.

La mayoría de las enzimas son biomoléculas, que catalizan una reacción química en soluciones acuosas y que mantienen el proceso metabólico en funcionamiento, cada enzima es muy específica y de alta eficiencia. Esto consiste en aumentar la velocidad de cada reacción, disminuyendo la energía de activación sobre las moléculas que participan en esta. [1]

Las fosfatasas son enzimas que actúan como catalizadores en la hidrolisis de ácido fosfórico inorgánico, se utilizan para liberar grupos fosfatos adheridos a otras moléculas. Existen dos tipos de estas enzimas, las fosfatasas acidas y las fosfatasas alcalinas, dependiendo del medio en el que existen. Cabe mencionar que estas enzimas presentan una característica importante y es que poseen especificidad por un amplio rango de sustrato [2]. Las fosfatasas acidas se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta la concentración en próstata, estomago, hígado, músculos, bazos, eritrocitos y plaquetas. También se encuentran presentes en las semillas de las plantas, aumentando su actividad durante la germinación y disminuyendo mientras la planta se desarrolla [3]. La fosfatasa alcalina se encuentra en todos los tejidos corporales. Los tejidos con cantidades más altas de estas fosfatasas son el hígado, las vías biliares y los huesos, siendo este último una de las mayores fuentes de fosfatasa alcalina, por eso en niños y adolescentes en etapas de crecimiento, normalmente tienen muy elevada esta enzima. [4]

La cinética enzimática nos habla de la velocidad de las reacciones químicas catalizadas por enzimas. El estudio de los parámetros cinéticos de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, como es controlada su actividad en la célula y como puede ser inhibida su actividad por fármacos, venenos o potenciada por otro tipo de moléculas, por lo tanto, es muy importante conocer estos parámetros cuando se quiere estudiar una enzima y como trabaja. [5]

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Practico Nº 3 y 4:” Enzimología 1 y 2.”

                                                                                     Nombre: Macarena González Bustos.

                                                                                      Profesores: José Pérez.

                                                                                                          Carolina Arriza

                                                                                      Fecha: miércoles 12 septiembre 2018.

                                                        Objetivos.

• General: Comprender acerca de cómo funciona la enzima fosfatasa, su actividad, características y utilización.
• Específicos:

- Analizar experimentalmente el significado de los componentes Km y Vmax para la búsqueda de los parámetros cinéticos.

-Entender los gráficos y las curvas de calibración de acuerdo a su concentración, absorbancia y el tiempo.

                                            Materiales.

• Tubos de ensayo.
• Micropipeta
• Vaso precipitado
• Gradilla
• Espectrofotómetro
• Baño termorregulador a 37 ° C
• NaOH 0.02 M
• Amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M pH 5.0
• PNP 60 uM
• Cubetas
• Sustrato p–nitrofeniL
•  Solución stock de enzima 5 mg / ml , preparar en BSA 0.1 %.

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                                                 Métodos.

1. Curva de calibración.

• Se rotularon los tubos de ensayo del 1 al 6. Para el tubo número 1 se agregó exclusivamente 6ml de NaOH a 0,02 M que corresponde a la muestra “blanco”. Para el tubo número 2 se agregó 5 ml de NaOH y 1 ml de PNP 60 uM. Para el tubo número 3 se agregó 4ml de NaOH y 2ml de PNP 60 uM. Para el tubo número 4 se agregó 3ml de NaOH y 3 ml de PNP 60 uM. Para el tubo número 5 se agregó 2 ml de NaOH y 4 ml de PNP 60 uM. Para el tubo número 6 se agregó 1 ml de NaOH y 5ml de PNP 60 uM.

Luego se adiciono 1 ml de cada solución en las cubetas y se ajustó el espectrofotómetro a 405 nm para posteriormente, medir aquella que corresponde al tubo número 1, la muestra “blanco” y luego todas las demás cubetas, para lograr medir la absorbancia de cada una de las soluciones y registrarlas. (Tubo mixto)

1. Rango Lineal.

• Se agrego 2 ml de Buffer Citrato y 2 ml de sustrato NPP 2,5 M en un tubo de ensayo para luego incubarlo en el baño termorregulador a 37°C durante 5 minutos.
• Se rotulo los tubos de ensayos del 1 al 5. Para cada tubo de ensayo se agregó 5.5 ml de NaOH y 0.5 ml de solución del tubo mixto.

Luego se agregó 500 ul de fosfatasa a cada tubo de ensayo durante ciertos intervalos de tiempo, donde al tubo 1 se agregó la enzima al minuto 0, al tubo 2 se agregó la enzima al minuto 5, al tubo 3 se agregó la enzima al minuto 10, al tubo 4 se agregó la enzima al minuto 15, y por último al tubo 5 se agregó la enzima al minuto 30. Posteriormente se adiciono 1 ml de cada solución en las cubetas, se ajustó el espectrofotómetro a 405 nm, se midió la absorbancia de las soluciones y se registraron.

1. Determinación de parámetros cinemáticos.

-Se rotularon tubos de ensayo del 1 al 5 y se agregó buffer citrato, agua y NPP según las cantidades que indica la siguiente tabla, con un volumen total de 4,5 ml.

Se incubaron los tubos de ensayo durante 15 minutos a 37°C y luego se agregó 500 ul de enzima fosfatasa a cada tubo y se incubo nuevamente por 15 minutos. Paralelo a este proceso se rotularon 5 tubos de ensayos y agregaron 5 ml de NaOH 0.1 M a tiempo 0 minutos y 15 minutos. Posteriormente de la solución con la enzima se tomaron 500 ul y agregaron a cada tubo en el tiempo cero, se midió la absorbancia en el espectrofotómetro a 405 nm y luego se hizo el mismo procedimiento, pero con los tubos de tiempo 15 minutos.

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