Extracion De Plasmidos

GUIA DE LABORATORIO Nº 7

EXTRACCIÓN DE PLÁSMIDOS

Profesor: Jhon Alejandro Acosta & Claudia Viviana Granobles

Auxiliar de docencia: Gina Marcela Jiménez

INTRODUCCIÓN

Toda la información genética esencial para la vida de la bacteria está contenida en una única molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlace covalente. Dicha molécula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas bacterias poseen además ADN extracromosómico, también circular y cerrado, denominado ADN plasmídico por estar contenido en los plásmidos. Éstos, portan información génica para muchas funciones que no son esenciales para la célula en condiciones normales de crecimiento. En términos bioquímicos la composición y estructura de los ácidos nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier célula.

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una unidad de replicación independiente del cromosoma. Por esto puede encontrarse más de una copia del mismo plásmido dentro de la célula bacteriana. En general los plásmidos de mayor tamaño se encuentran en una o unas pocas copias, mientras que los más pequeños pueden estar en hasta cien copias por célula (plásmidos multicopia). Aunque el ADN plasmídico no porta información genética esencial para la vida de la bacteria, sí porta genes que le confieren nuevas propiedades fenotípicas y que en algunos casos le son útiles para su adaptación al crecimiento en determinados ambientes. Muchas bacterias potencialmente patógenas para el hombre, solo son capaces de comportarse como tales cuando portan un plásmido que contiene genes que le permiten expresar moléculas de adhesión a los tejidos del huésped o sintetizar sustancias tóxicas para éste. En otros casos, los plásmidos contienen genes que codifican enzimas capaces de degradar algunos antibióticos, permitiendo que la bacteria sobreviva a la acción de los mismos. Los plásmidos pueden clasificarse según distintos criterios, por ejemplo por su tamaño, su número de copia o el tipo de genes que contiene (plásmidos de virulencia, plásmidos de resistencia a antibióticos, etc.).

OBJETIVO

1. Obtener DNA plasmídico de células bacterianas anteriormente cultivadas.

2. Comprender la importancia y la utilidad del procedimiento, además de conocer de qué manera es utilizado en los diferentes campos de la biología como en ingeniería genética y microbiología.

MATERIALES Y REACTIVOS

• Tubos eppendorf, de lavado y de columna.

• Micropipetas.

• Centrífuga refrigerada.

• Baño maría.

• Termómetro.

• Buffer R3.

• Buffer lisis L7.

• Buffer de precipitado LN4.

• Buffer de lavado W10 y W9.

• Buffer TE.

PROCEDIMIENTO

Antes de empezar

• Añadir RNasa A al tatampón de resuspensión (R3) de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta, se mezcla y se debe marcar la etiqueta de la botella después de la adición de RNasa A.

• El tampón de lisis (L7) debe estar brevemente a 37°C para volver a disolver cualquier material particulado.

• Añadir etanol al 90% a la solución de lavado (W9) y al tampón de lavado (W10) según las instrucciones en la etiqueta y mezclar bien.

• Cultivar en laboratorio E. coli en 1-5 ml de medio LB durante la noche.

Procedimiento de purificación utilizando centrifugación:

Siga este procedimiento para purificar el ADN plásmídico utilizando una centrífuga. Utilice una microcentrífuga capaz de centrifugar a > 12000 × g (gravedad. Para procesar un gran número de muestras simultáneamente.

Notas

• Realice todas las etapas de centrifugación a temperatura ambiente utilizando una microcentrífuga.

Extracción de ADN plasmídico:

 LISADO:

1. Recoja de 1 hasta 5 ml de cultivo de bacterias que estuvieron previamente en crecimiento durante la noche en un tubo eppendorf de 2ml.

2. Centrifugar a 4000 rpm por 2 minutos.

3. Eliminar el sobrenadante.

4. Resuspender el pellet en 250 del buffer R3.

5. Agregar 250 del Buffer L7 (lisis), mezcle por inversión gentilmente 5 veces.

6. Incubar 5minutos a

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