Informe Cinetica BQ

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Irjuba Bioquímica I

2º Grado en Biología

Facultad de Biología Universidad de Vigo

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.

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Estudio de la enzima β-D-galactosidasa en sobrenadante de hígado de rata.

Bioquímica I: prácticas 2 a 5

2º BIOLOGÍA 2020/2021

Iria Juárez Bastos Laura Portela Couñago

Grupo 4

Universidad de Vigo

ÍNDICE:

PRÁCTICA 2.- DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA β- DGALACTOSIDASA EN SOBRENADANTE DE HÍGADO DE RATA        1

Parte a) Elaboración de una recta patrón de PNF        1

Parte b) Valoración de la actividad de la enzima β-D-galactosidasa        2

PRÁCTICA 3.-DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO DE LA ENZIMA β- DGALACTOSIDASA        5

PRÁCTICA 4.- EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA β-D-GALACTOSIDASA. CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS        7

PRÁCTICA 5.- EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ESTABILIDAD DE LA ENZIMA β-D-GALACTOSIDASA        10

TABLAS:

Tabla 1: Resultados obtenidos absorbancia y micromoles de PNF para elaboración recta patrón PNF        1

Tabla 2: Resultados obtenidos de absorbancia, diferencia de absorbancias y micromoles de PNF para estudiar actividad enzimática        2

Tabla 3: Resultados obtenidos de absorbancia, diferencia de absorbancias y porcentaje de absorbancia para el estudio del pH óptimo de la enzima        5

Tabla 4: Resultados de absorbancia y parámetros cinéticos        7

Tabla 5: Resultados de absorbancia con las distintas temperaturas        10

GRÁFICOS:

Gráfico 1: Recta patrón PNF        2

Gráfico 2: Representación del pH frente a la absorbancia de la enzima        5

Gráfico 3: Curva de Michaelis-Menten        8

Gráfico 4: Recta de Linneawever-Burk        8

Gráfico 5: Gráfico porcentaje de absorbancia frente a temperatura        10

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ESTUDIO DE LA ENZIMA β-D-GALACTOSIDASA EN SOBRENADANTE DE HÍGADO DE RATA

PRÁCTICA 2.- DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA β- DGALACTOSIDASA EN SOBRENADANTE DE HÍGADO DE RATA

El objetivo es calcular la actividad de la enzima estudiada, por lo que debe tenerse en cuenta que cataliza la hidrólisis de moléculas que presenten D-galactosa unida mediante un enlace β (1,4) a otro monosacárido. Por ello, se utilizará como sustrato p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (PNF- gal), pues presenta dicho enlace y el producto de su catálisis es medible en espectrofotómetro a 400 nm (es de color amarillo).

En primer lugar, debe elaborarse una recta patrón de PNF, para poder interpolar las concentraciones de las muestras. Esta se obtiene midiendo la absorbancia de diez soluciones de diferente concentración. A continuación, se prepara un tubo con sustrato, tampón de pH 4 y muestra enzimática diluida 3 veces. Se incuba a 37ºC durante 20 minutos, tras lo que se detiene la reacción con Na2CO3 y se mide la absorbancia a 400 nm. Con los datos obtenidos se calcularán las variables cinéticas necesarias.

Parte a) Elaboración de una recta patrón de PNF

RESULTADOS:

Tabla 1: Resultados obtenidos absorbancia y micromoles de PNF para elaboración recta patrón PNF

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1. Elaborar una recta patrón de PNF, representando en abscisas los μmol PNF y en ordenadas la absorbancia a 400 nm de cada tubo.

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Gráfico 1: Recta patrón PNF

1. Obtener la ecuación de la recta y su 𝑹𝟐 , que debe ser >0.98.

La ecuación de la recta es la siguiente: y = 0’006 x + 0’048. Su coeficiente R2  es de 0’991, lo que indica que la recta se ajusta correctamente a los valores reales obtenidos.

Parte b) Valoración de la actividad de la enzima β-D-galactosidasa

RESULTADOS:

Tabla 2: Resultados obtenidos de absorbancia, diferencia de absorbancias y micromoles de PNF para estudiar actividad enzimática.

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