La Cromatografía.

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• Introducción

La reacción de Sanger es útil para la determinación en péptidos y proteínas de los aminoácidos con el grupo alfa amino libre.
El DNFB (1-Fluoro-2,4-dinitrobenceno) reacciona con dichos grupos aminos libres en condiciones ligeramente alcalinas formando los dinitrofenilderivados (DNP-aa) estos DNP de aminoácidos terminales son no polares por lo que se pueden extraer con un disolvente no polar mediante una cromatografía en capa fina o en papel.

¿Qué es la hemoglobina? Es una proteína con estructura cuaternaria es decir, está constituida  de cuatro cadenas polipeptídicas: 2 α y 2 β, contiene cada una un grupo proteico, el hem, un tetrapirrol cíclico que les proporciona el color rojo.

• Objetivo

• Aplicar correctamente el metodo de Sanger para la identificación del aminoacído terminal de la hemoglobina y así obtener los resultados deseados.
• Comprobar que aminoácido se encuentra presente en la hemoglobina.                  .
  

• Resultados y Cálculos

Tabla 1. Resultados obtenidos a partir de la cromatografía.

 
Formula:
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Sustutución: [pic 8][pic 9]

*Nota: todos los cálculos se realizan de la misma manera.

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Imagen 1. Fotografía de la cromatografía realizada y manchas encontradas. (Resultados en la tabla 1.)

• Discusión de resultados.

Como ya sabemos la hemoglobina es una proteína tetramerica con cuatro aminoácidos N-terminal iguales, los cuales son de nuestro interés identificar por lo cual comenzamos por disolver en bicarbonato de sodio el cual desprotonara nuestra proteína en un medio ligeramente básico, que permite que el DNFB comience a reaccionar con los grupos amino libres; para detener esta reacción adicionamos HCl 3N a un pH 3, formando los dinitrofenil derivados pero la Sol. De DNFB está en exceso en nuestro medio, la cual eliminamos realizando 3 extracciones de éter para aumentar la eficiencia y evaporamos el éter que pudiese quedar con nuestra proteína.
A continuación centrifugamos y adicionamos HCl 6N aplicando temperatura a 15 libras por tres horas en la autoclave para romper todos los enlaces peptídicos y obtener nuestro hidrolizado de proteínas, pero en el hidrolizado no solo se contiene nuestro aminoácido terminal sino que también se obtiene los DNP derivados de otros aminoácidos como la histidina, tirosina y lisina que no son de nuestro interés y para deshacernos de ellos llevamos a cabo extracciones con éter quedando estos en la fase acuosa y  los DNP-aa terminales que son no polares quedarán en la fase etérea, por último eliminamos el exceso de éter evaporando a sequedad y el residuo disolvemos en 0.5 ml de acetona para llevar a cabo la cromatografía en papel que comparando los Rf del aminoácido problema a los de los aminoácidos tipo, y de acuerdo a la literatura el aminoácido obtenido fue la Valina y otra mancha observada de trazas de DNFB.

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