Cromatografia

El botánico ruso Mikhail S. Tsvet instauró el uso de la cromatografía en los estudios científicos alrededor de los años 20. Usó este método en la separación de los pigmentos naturales que se encuentran en las plantas. Las carotenoides y clorofilas son las responsables de dar color a dichos pigmentos.

La cromatografía es una técnica de separación utilizada en el ámbito de la química. En esta práctica se han utilizado dos métodos de separación. Por un lado, la cromatografía por capa fina y por otro lado la cromatografía en columna.

Las técnicas de separación sólo sirven para separar ya que nos dan ninguna otra información acerca de la naturaleza de los componentes separados, de ahí que en la mayoría de los casos estas técnicas o métodos de separación van acompañados de otros métodos de análisis con el fin de identificar y a veces cuantificar los componentes separados.

b) Cromatografía. Definición

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.

El proceso cromatográfico se caracteriza por la dificultad en el paso de los distintos componentes dela muestra a través de la fase estacionaria a medida que son arrastrados por la fase móvil (elución). Dicha dificultad provoca la retención de dichos componentes en menor o mayor grado según las diferencias entre las constantes de distribución existentes ente la fase estacionaria y la móvil.

c) Cromatografía. Conceptos

Fase estacionaria

Es una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un líquido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o no contribuir al proceso de separación.

Fase móvil

Fluido que se filtra a lo largo de la fase estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía líquida, LC), un gas (cromatografía de gases, GC) o un fluido supercrítico (cromatografía con fluido supercrítico).

Elución

Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria transportando los componentes a separar. El proceso de elución se puede detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico o continuar hasta que lo hayan abandonado.

Efluente

Nombre que se la da en el momento que la fase móvil abandona la columna.

d) Tipos de Cromatografía

Cromatografía en columna

La característica fundamental de la cromatografía clásica en columna es que el gradiente de presión viene necesario para el desplazamiento de la fase móvil viene dado por la gravedad. Los lechos cromatográficos utilizados para columnas, son generalmente de un solo uso y se preparan en el propio laboratorio.

El recipiente es normalmente un tubo de vidrio que mediante una llave de paso se regula el flujo de la fase móvil. Es muy importante que la fase estacionaria esté distribuida de forma homogénea, sin fracturas ni burbujas de aire, siendo también fundamental que los extremos de la columna sean planos para evitar eluciones simultáneas de más de una fracción, especialmente si la capacidad de separación de la columna no es muy grande. El método más recomendable de llenado consiste en añadir al tubo, una vez colocado en posición vertical, una pasta formada con la fase estacionaria y un disolvente de menor actividad que la fase móvil, dejando salir el disolvente sobrante a medida que la fase estacionaria va sedimentando.

La capacidad de separación de las columnas de gravedad no es muy grande ya que su eficacia viene dada por el tamaño de las partículas de la fase estacionaria ya ésta debe ser bastante alto para permitir un caudal razonable de la fase móvil. La relación entre el diámetro y la longitud de la columna es también importante, ya que columnas demasiado cortas no proporcionarán espacio suficiente para lograr la separación deseada.

Mediante alguna otra técnica como la cromatografía en capa fina se analizan los productos obtenidos a medida que van saliendo de la columna por elución. Para ello se recogen un gran número de pequeñas fracciones.

Cromatografía en capa fina

Cromatografía en capa fina se utiliza en un lecho abierto formado por una capa fina de fase estacionaria soportada sobre una superficie plana. La elución se consigue por el movimiento capilar ascendente de la fase móvil. Las fases estacionarias utilizadas normalmente para cromatografía en capa fina son, alúmina o gel de sílice para cromatografía de adsorción. El proceso se lleva a cabo en recipientes cerrados, por ascensión del disolvente, debiendo colocarse en el interior del recipiente cubriendo una de sus paredes una capa de papel de filtro impregnado en la fase móvil (disolvente) para conseguir una atmósfera saturada en ella. Una vez desarrollada la placa, la visualización de los cromatogramas se realiza mediante iluminación con luz ultravioleta, si a ojo humano no es posible verlos.

Tras el desarrollo, la identificación de cada componente de la mezcla se realiza midiendo el desplazamiento relativo de cada mancha en la placa respecto a un compuesto patrón o al frente del disolvente, definiéndose para cada banda sus valores Rf(A) o Rf(B) respectivamente (Figura 2).

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