La bacteria gram negativa E

PCR Y ELECTROFORESIS DE DNA EN Escherichia coli

Universidad de sucre, Facultad de educación y Ciencias, Programa de Biología

MARCO TEÓRICO

La bacteria gram negativa E. coli, la cual  es un habitante común de los intestinos de todos los animales, incluyendo el de los humanos. E. coli es quizás el organismo procarionte más analizado por el ser humano, se trata de una bacteria unicelular que se encuentra generalmente en los intestinos animales y en aguas servidas o residuales. Cuándo se usan métodos de cultivos aeróbicos, esta bacteria es la especie dominante encontrada en las heces.1 La PCR se basa en la replicación de DNA por medio de la intervención de ciertas proteínas que permiten que se copie la información genética a partir de una cadena molde. Los iniciadores de la PCR conocidos como primers, son oligonucleótidos sintéticos que hibridan a la región complementaria del DNA  que actúa como molde, que se desea amplificar y propician el inicio de la reacción de elongación por parte de la  Taq DNA polimerasa.2 La electroforesis de los ácidos nucleicos es el método más empleado para separar, identificar y purificar moléculas   de DNA. La electroforesis de ácidos nucleicos se lleva a cabo en geles de agarosa y se considera un método sencillo y altamente eficiente para separar fragmentos de DNA. Una de las características es que los ácidos nucleicos están cargados negativamente debido a los grupos fosfatos, una vez que el DNA es expuesto al campo eléctrico y en soluciones buffers migra hacia el polo positivo o ánodo debido a la afinidad de la molécula con las cargas de tipo positiva. Cada molécula aporta una carga negativa y la relación carga masa de cada molécula es la misma independiente del tamaño; por lo tanto la migración o movilidad del DNA en un gel va depender del tamaño o conformación así como también del poro del gel. Después de la electroforesis los fragmentos de DNA pueden observarse al utilizar compuestos fluorescentes.4 Para estudios investigativos se hizo necesario implementar métodos que facilitaran el conocimiento funcional del DNA, debido a todo esto surgió el mecanismo popularmente conocido como la PCR, esta se caracteriza por ser una reacción bioquímica in vitro catalizada por una enzima, en la cual pequeñas cantidades de un segmento específico de DNA, que se hallan entre dos regiones del DNA de secuencia conocida, son amplificadas obteniéndose una gran cantidad de DNA lineal de doble cadena.5 

Debido a que la PCR está basada en la acción enzimática de una DNA polimerasa (comúnmente utilizada es la Taq DNA Polimerasa I que es una de las enzimas extensamente caracterizada y aplicada en biología molecular), la tecnología de la PCR fue aplicada inmediatamente en varias áreas de investigación, incluyendo la tecnología del DNA recombinante, la expresión génica, medicina general, medicina forense y evolución. Actualmente, la tecnología de la PCR ha adquirido mayor importancia con el desarrollo de las enzimas de restricción, con el clonaje del DNA y con el Southern blotting en el avance de la biología molecular. Los primeros experimentos de amplificación con PCR fueron realizados por el Dr. Mullís y el Dr. Fred A. Faloona, un matemático quien desarrolló el primer dispositivo automático regulador de la temperatura en ciclos, conocido como termociclador o máquina de PCR (Mullís y Faloona, 1987).3 OBJETIVOS

• Describir las pautas y recomendaciones generales para la reacción en cadena de polimerasa (PCR).
• Amplificar un fragmento de DNA de Escherichia coli utilizando cebadores específicos.          Realizar la electroforesis de moléculas de DNA a través de geles de agarosa.

METODOLOGÍA

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[pic 2]

Imagen 1. Gel de agarosa en transiluminador luego de PCR y electroforesis. Los números del  l al 12 corresponden a los pozos de sembrado mientras M: Marcador de Peso Molecular. Los números a la izquierda son los pesos moleculares de cada uno de los fragmentos indicados en el gel por el M encerrando de forma secuencial en rectángulos de líneas rojas al DNA separado. Unidad de tamaño del M en pares de bases (pb).  

ANÁLISIS DE RESULTADOS

La técnica  de PCR es la propiedad natural de las DNA polimerasas que nos permite replicar hebras de DNA, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de DNA recién formadas entre sí tras cada fase de replicación. Durante esta práctica se realizó la PCR de moléculas de DNA de E. Coli a través de un gel de agarosa que nos proporcionó la visualización de contenido de DNA  mediante el barrido.

Cabe  resaltar que  el uso de los reactivos que son los activadores de los procesos para llevar a cabo el proceso completo de PCR lo cual  es de suma importancia saber las funciones que cumplen cada uno de ellos y que son:

• Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), estos sustratos fueron de gran importancia para polimerizar nuevo DNA.
• Dos primers (oligonucleótidos), son secuencias cortas, de entre 6 y 40 nucleótidos, normalmente de 18 a 22 nucleótidos, estos permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar de frente y no a mucha distancia. Delimitan la zona de DNA que se va a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
• Magnesio (Mg2+), actúan como cofactores de la polimerasa.
• Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la DNA polimerasa.
• DNA polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).
• DNA molde, que contiene la región de DNA que se va a amplificar.
• Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Los reactivos utilizados se mantienen a temperaturas bajas para evitar su degradación y antes de ser utilizados fueron colocados en agua con hielo.

La electroforesis realizada fue de tipo horizontal, la cual accede a trabajar con DNA o ARN y permite visualizar estas moléculas a manera de simples bandas, que pueden ser analizadas posteriormente. En este método la separación de macromoléculas como el DNA depende de dos variables: la carga que posee y la masa de la misma molécula. Es importante destacar que el termino electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.4 

Para la desnaturalización del DNA molde se utilizaron temperaturas en 90 y 95°C la cual produce la ruptura de los puentes de hidrogeno intercaternarios dando así la separación de la doble hélice de DNA. Y para que ese proceso se mantenga la  temperatura debe ser constante por lo menos por 5 min.  

Basándonos en los resultados obtenidos de la electroforesis se puede observar en la (figura 1)  que los presentaron una mejor corrida fueron los posos 1, 2, 5, 6, 7, 8 y 12 los cuales se encuentran en un rango aproximado de 900 a 3000bp. De esto se puede deducir que hubo una buena extracción del material genético obteniendo así resultados positivos para estas muestras.  Y los posos 3, 4, 9, 9 y 10 están en un rango de 1000 a 3000bp lo cual tan bien es positivo y el poso 11 no se corrió la muestra así que se puede deducir que tal vez no tomaron las cantidades adecuadas de los reactivos mostrando una muestra con un resultado negativo.  

Se trabajó con el Orange G el cual es un colorante de seguimiento utilizado en la electroforesis de ácidos nucleicos para realizar un seguimiento delante de DNA en geles de agarosa. También se utiliza en la electroforesis el SDS- capilar como un estándar. Por lo general se ejecuta en 50 puntos básicos hasta en un 2,5 % de agarosa. Y el  syber Safe es un colorante muy sensible con una elevada afinidad por el DNA, que puede detectar cantidades de tan sólo 50 pg de DNA. Se utiliza en una dilución 1/10.000 en agua para el teñido del gel tras la electroforesis su función como agente intercalante en donde una molécula plana e hidrófoba que se inserta entre los pares de bases contiguos de la doble hélice, y así  interrumpe la alineación y el emparejamiento de bases de las cadenas complementarias por el cual se da un desenrollamiento parcial y una reducción de la torsión; al intercalarse en el DNA este distorsiona la doble hélice y nos permite su visualización.5  

Al momento de realizar la preparación del Gel de agarosa hay que tener mucho cuidado ya que este no debe contaminarse, se tienen que realizar los pasos con mucho cuidado para obtener un buen molde como por ejemplo al gel en estado líquido se le agrega el syber safe sustancia química que funciona como agente intercalante si esto no se realiza no se lograra observar nada al momento de realizar la electroforesis, si se le agregara al solidificarse no funcionaria. Y otro aspecto importante es que al retirar el gel del molde en el que se solidifico ahí que hacerlo con mucho cuidado ya que este puede agrietarse y al momento de realizar la electroforesis esta no pase por las grietas y no se observe nada.  

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