La fosfatidiletanolamina es un regulador clave de la membrana

La fosfatidiletanolamina es un regulador clave de la membrana

Fluidez en células eucariotas *

Se requiere una fluidez de membrana adecuada para una variedad de claves procesos celulares y en particular para el correcto funcionamiento de los miembros proteínas de la brana. En la mayoría de las células eucariotas, la fluidez de la membrana es conocido por estar regulado por la desaturación de ácidos grasos y la coles- terol, aunque algunas células, como las de insectos, están casi desprovistas de la síntesis de esteroles. Mostramos aquí que insectos y mamíferos Las células presentan una microviscosidad similar en sus respectivas fisio- temperatura lógica. Para investigar cómo tanto los esteroles como los Los folípidos controlan la homeostasis de la fluidez, cuantificamos la concentración lipídica Composición de las células SF9 de insectos y HEK 293T de mamíferos en condiciones normales o modificadas con esteroles. Como era de esperar, insecto las células muestran esteroles mínimos en comparación con las células de mamíferos. UN También se observa una diferencia importante en el contenido de fosfolípidos como proporción de fosfatidiletanolamina (PE) a fosfatidilcolina (PC) está invertido (4 veces más en celdas SF9). Estudios in vitro en Los liposomas confirman que tanto el colesterol como el PE pueden aumentar rigidez de la bicapa, lo que sugiere que ambas pueden ser utilizadas por las células para mantener la fluidez de la membrana. Luego mostramos que exógenamente el aumento de la cantidad de colesterol en las membranas SF9 conduce a una disminución significativa en la relación PE: PC mientras que la terol en células HEK 293T mediante el tratamiento con estatinas conduce a una aumento de la relación PE: PC. En todos los casos, la fluidez de la membrana es mantenido, lo que indica que ambos tipos de células combinan regula- los esteroles y fosfolípidos para controlar la adecuada fluidez de la membrana.

El mantenimiento de la fluidez adecuada de la membrana celular es fundamental importancia fundamental para la difusión adecuada de los componentes de la membrana desde los lípidos hasta las proteínas e influye en la dinámica y ción de proteínas integrales de membrana. También es responsable de su notable flexibilidad y, por lo tanto, requerido para una multitud de transformaciones morfológicas necesarias para las funciones celulares incluyendo división, diferenciación y adaptación general a el medio ambiente (1, 2). En las bacterias, la fluidez de la membrana está regulada principalmente por ing la longitud y saturación de las cadenas de acilo (3). Por ejemplo, al bajar la temperatura de crecimiento, las bacterias típicamente aumentar considerablemente el contenido de cadenas de acilo insaturadas, acortar longitud de la cadena y modificar la ramificación o ciclación para reducir la temperatura de transición de fase de gel a líquido-cristalino estado, un proceso llamado adaptación homeoviscosa (4). En mamma- células lianas, se sabe que la fluidez de la membrana también está regulada por colesterol, que tiene la capacidad de producir líquido de membrana interfiriendo con el empaquetamiento de la cadena de acilo, inhibiendo la transición a estado de gel sólido, pero al mismo tiempo branas al reducir la flexibilidad de las vecinas insaturadas cadenas de acilo (5, 6). Las membranas de los orgánulos celulares necesitan adaptar sus propiedades y así su composición según la función que necesiten cumplir (2, 5). De hecho, se sabe que el porcentaje total de elección lesterol varía ampliamente entre los orgánulos implicados en tráfico de células; es bajo en retículo endoplásmico (5% de lípidos), y su cantidad aumenta en el trans-Golgi y la membrana plasmática brana, lo que permite un empaque más apretado compatible con el plasma función de la membrana como barrera (5, 7). Por lo tanto, las células animales son sometido a una regulación fina de colesterol y grasas síntesis de ácido a través de la unión del elemento regulador de esterol vía de la proteína (SREBP) (8). En este contexto, un desequilibrio en La composición de lípidos de la membrana podría afectar la vínculos y conducir a consecuencias patológicas como se describe para membranas de eritrocitos en pacientes con hipercolesterolemia y en diabetes tipo 2 (9, 10). De hecho, un aumento del colesterol: fósforo La proporción de folípidos (PL) 4 conduce a una disminución de la fluidez de la membrana y se asocia con una unión reducida de insulina (9). Por el contrario, algunos eucariotas superiores, como los insectos, no sintetizar esteroles. Aunque los estudios de espectrometría de masas han demostrado que las membranas de las células de insectos contienen las principales clases de PL encontrado en células de mamíferos, la presencia de esteroles es estrictamente dependiente de la dieta (11). Cómo las células perciben y regulan la mezcla compleja y dis- La contribución de los lípidos para preservar las características de las membranas es, por lo tanto, una pregunta importante y desafiante. En este trabajo, comparamos la regulación de la distribución de lípidos de la membrana y su consecuencia en la fluidez de la membrana de dos ampliamente modelos utilizados de células eucariotas, SF9 de insecto y células HEK 293T humanas. Usando un sistema de cromatografía líquida acoplado a una alta resolución espectrómetro de masas de lution, determinamos la composición de lípidos de ambas membranas. Mostramos que a pesar de las diferencias en su contenido de colesterol y fosfatidiletanolamina (PE) la fluidez de ambas membranas fue similar. Mostramos que la gripe La idoneidad en las membranas SF9 y HEK 293T está regulada de manera similar. De hecho, un cambio en las cantidades de colesterol no afectó a los miembros fluidez de la brana de ambas células, pero resultó en una modulación inversa del contenido de PE. Nuestros hallazgos apuntan a una compensación conservada equilibrio entre el colesterol y el metabolismo de la PE que podría ser necesario para el control de la fluidez de la membrana.

• Procedimientos experimentales Cultivo celular:

las células SF9 se cultivaron en ESF 921 sin proteínas medio de Expression Systems a 27 ° C con agitación de 130 rpm ción. Para aumentar la cantidad de colesterol, se cultivaron células durante cinco pases (7-10 días) en ESF 921 complementado con un 10% suero de ternero fetal (FBS) (Lonza). Las células HEK 293T se cultivaron en DMEM (Lonza) suplementado con FBS al 10%, 4,5 mg / ml de glu- cose, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM a 37 ° C con 5% CO2. Para el tratamiento con estatinas, se preparó una solución madre de simvastatina. pelado y activado por el siguiente método. Primeros 54 mg de La simvastatina se disolvió en 1,04 ml de etanol al 95% y luego 813 - Se añadió 1 de NaOH 1 N. La solución resultante fue neutralizado con 1 N HCl a un pH de 7,2 y llevado a 13 ml con agua destilada. A continuación, se dividió en alícuotas el stock de 10 mM y almacenado en - 20 ° C hasta su uso. Antes del tratamiento con simvastatina, las células a tratar y los controles se cultivaron durante 48 h en suero DMEM libre suplementado con insulina, transferrina y sele- nium (todos de Gibco), 0,1 mg / ml de BSA, 4,5 mg / ml de glucosa, 1 mM piruvato de sodio, L-glutamina 2 mM a 37 ° C con 5% de CO2. próximo 75 - Se añadió M simvastatina sólo para las células tratadas con estatinas; estafa- las células trol permanecieron libres de estatinas. Luego, las células se recolectaron después 48-50 hy se lavó con solución salina tamponada con fosfato y pel- se almacenaron en - 80 ° C para la preparación de la membrana. Estándares de lípidos: se utilizaron los siguientes estándares: para fosfatidilcolina (PC), PE, fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilserina (PS) y esfingomielina (SM), C12: 0 C12: 0 y C17: 0 C17: 0; para fosfatidilinositol (PI), C18: 0 C20: 4 y [2,3,4-13C3] colesterol. Las curvas estándar fueron hechas por MS análisis usando series de dilución de estándares (de 0.02 a 5 10- 5 mg / ml para fosfolípidos y de 0,2 a 0,002 mg / ml para colesterol). Todos los estándares de fosfolípidos se adquirieron en Avanti- Polar lipids, Inc. [2,3,4-13C3] Se purificó el colesterol perseguido de Sigma. Preparación de membranas y extracción de lípidos de membranas. Pellets de células (20106 células para HEK 293T y 60106 células para SF9) se transfirieron a tampón de lisis hipotónico (10 mM Tris, pH 7,4, EDTA 1 mM) y se agitó durante 15 min para romper las células. Las células lisadas se centrifugaron a 25.000 g durante 10 min, y el Los gránulos que contenían las membranas se resuspendieron en fósforo. solución salina tamponada con fato. Este procedimiento se llevó a cabo a 4 ° C. Estándares para cada clase de fosfolípidos y colesterol [13C3] se agregaron a la membrana, y luego se extrajeron los lípidosde membranas usando una solución de metanol: cloroformo (50:50, v / v) como lo describen Bligh y Dyer (31) con lo siguiente modificaciones. 10 - Se añadió 1 de HCl 6 N a la mezcla, y La extracción se repitió tres veces en la misma muestra para tener máxima recuperación de todo tipo de lípidos. Orgánico correspondiente las fases se agruparon, el disolvente se evaporó bajo una corriente de nitrógeno, y los lípidos se disolvieron en diclo- romometano: isopropanol (1: 4, v / v) antes del análisis de EM. Análisis de espectrometría de masas: dos microlitros de cada muestra ple fue inyectado en una cromatografía líquida de rápida resolución (LC) (serie 1200 de Agilent Technologies) equipado con una columna Zorbax XDB Eclipse Plus (C18, 4.6 50 mm, 1.8-- metro tamaño de partícula). La corrida duró 30 minutos con las siguientes características: características: caudal, 0,3 ml / min; temperatura de la columna, 40 ° C. La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1% (análisis de MS positivo) o 5 acetato de amonio mM, pH 5 (análisis de MS negativo) y La fase móvil B fue un gradiente de isopropanol, que comenzó con 90% de disolvente A, aumentado directamente al 20% en 10 min, permaneció en 20% de disolvente A durante 15 min, y se volvió a equilibrar para comenzar condiciones en 5 min. Una fuente de iones por electropulverización (ESI) serie 6520 - Espectrometría de masas de alta resolución de tiempo de vuelo cuadrupolo (QTOF) Se utilizó un trómetro de Agilent Technologies. Para la EM / EM análisis, se utilizó el modo auto-MS / MS, y los parámetros fueron los sigue: modo positivo o negativo; adquisición de alta resolución modo (4 GHz); temperatura del gas, 330 ° C; gas de secado, 7 litros / min; presión del nebulizador, 50 p.s.i.g .; voltaje capilar, - 4500 V; frag- mentor, 210 V; energía de colisión fija, 25 V; Rango de escaneo MS y frecuencia, 100-1700 a cuatro espectros por segundo; Rango de escaneo MS / MS y frecuencia, 50-1700 a tres espectros por segundo; auto-MS / MS, tres precursores máximos; umbral absoluto de precursor, 200 cuenta; exclusión activa en dos repeticiones y liberada después de 0.5 min; rango de exclusión fijo, 100– 499 y 1500–1700; privilegiado estado de carga, 1 y 2. Los datos fueron adquiridos por Mass Hunter Adquisición- para TOF y QTOF versión B.04 SP3 (Agilent Tecnologías). Para la cuantificación, se realizaron análisis de EM formado con los siguientes parámetros: positivo o negativo modo; modo de rango dinámico extendido (2 GHz); temperatura del gas temperatura, 330 ° C; gas de secado, 7 litros / min; presión del nebulizador, 50 p.s.i.g .; voltaje capilar, 4500 V; fragmentador, 210 V; Escaneo de MS rango y frecuencia, 100-1700 a dos espectros por segundo. Los datos fueron adquirida por Mass Hunter Acquisition para las versiones TOF y QTOF sión B.04 SP3. Se analizaron las fosfatidilcolinas y el colesterol. lizado en modo positivo, mientras que los otros PL se analizaron en modo negativo. Análisis y cuantificación de datos: los datos se analizaron primero lizado por Mass Hunter Qualitative Analysis versión B.06 SP1 basado en un modo de búsqueda basado en fragmentos. Brevemente, el MS / MS Los espectros obtenidos durante el tiempo de ejecución se seleccionaron de acuerdo con la fragmentación específica de cada PL. En modo negativo, el el modo de búsqueda se centró en los fragmentos de ácidos grasos (C16: 0; C16: 1; C14: 0; C14: 1, C18: 0. . . ). En modo positivo, la búsqueda El modo se centró en los fragmentos de la cabeza polar del PL. El error máximo aceptado en m / z detectado fue de 5 ppm. Respecto a cuantificación, las muestras se procesaron en modo MS simple. Cromado de iones Los matogramas se extrajeron en base a las masas exactas del lípidos observados durante los análisis de auto-MS / MS. Fosfolípidos fueron cuantificados por las curvas estándar (con concentración de masa ciones) se ejecutan durante el conjunto de experimentos. Formación de liposomas y determinación de tamaño por dinámica Dispersión de luz: lípidos utilizados para la formación de liposomas (POPE, POPC y colesterol) se compraron a Avanti Polar Lipids, Inc. Se prepararon mezclas de lípidos con los siguientes procedimiento. POPC se mezcló con 0, 10, 20 o 30% (p / p) de cho- lesterol; con 40, 50 o 60% (p / p) de POPE; o con 10% de colesterol terol además de 30 o  60% (p / p) de POPE a una concentración final de lípidos concentración de 3 mg / ml en HEPES 100 mM, pH 7,4. Liposomas[pic 1]

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