Laboratorio fermentación
robertvlInforme6 de Octubre de 2018
4.191 Palabras (17 Páginas)142 Visitas
Índice
1.- Introducción 2
2.- Materiales y Métodos 3
3.- Resultado y Discusiones 7
3.1.- Cultivo por lote 7
3.2.- Calculo de Parámetros Cinéticos de E.coli 8
3.3.- Método Dinámico para determinar el Kla y QO2 9
3.4.- Cultivo Continuo 14
3.5.- Método del Lavado 18
Tabla 1 Parámetros obtenidos de la fermentacion por lotes 4
Tabla 2. . Datos obtenidos del Gassing out 6
Tabla 3. Resultados del Gassing in. 7
Tabla 4. Resultados de kla corregido 9
Tabla 5. Datos operativos en estado estacionario del experimento. 11
Tabla 6. Tiempos de espera para alcanzar estado estacionario. 12
Tabla 7.Resultados método del lavado. 15
Figura 1. Variación de la concentración de biomasa y glucosa en el Bacht 2
Figura 2.Obtención de µmax mediante fermentación por lotes. 3
Figura 3. Variacion de Concentración de Oxígeno disuelto 5
Figura 4. Ajuste de datos para el cálculo del kla. 6
Figura 5. Tiempo de respuesta del electrodo de oxígeno. 8
Figura 6.Ajuste de datos para obtención de kla considerando respuesta de primero orden del electrodo 9
Figura 7. Variación de la concentración de biomasa [gr/l] durante el experimento 12
Figura 8. Variación de la TOD durante la fermentación. 13
Figura 9. Variación de la concentración durante el lavado del cultivo 14
Figura 10. Obtención de µmax mediante el método del lavado. 15
1.- Introducción
La ingeniería de fermentaciones tiene como objetivo la optimización de reactores biológico, de manera de optimizar el producto de interés, ya sea el material biológico, productos asociados al crecimiento o metabolitos secundarios. Para esto, se han establecido distintas modalidades de fermentación, ya sea un cultivo por lotes, continuo y por lotes alimentado (Acevedo, Gentina & Illanes, 2002).
El cultivo por lotes se caracteriza por ser un proceso simple, donde sus limitaciones vienen dadas por la falta de control de los parámetros cinéticos, tales como la velocidad específica de crecimiento y la concentración de sustrato. Para poder controlar estos parámetros, se utiliza un cultivo continuo, donde la velocidad especifica de crecimiento viene controlada por el flujo de alimentación a utilizar, generándose dentro del reactor un estado fisiológico definido, estable y controlable.
El cultivo continuo tiene las ventajas de poseer alta productividad volumétrica, y principalmente, tener un flujo de salida conocido y constante, lo cual es de interés industrial, debido a que permite controlar la calidad del producto final de interés. Cabe mencionar que presenta desventajas frente al cultivo por lotes cuando se comparan factores como los equipos a utilizar (el cultivo continuo requiere de equipos más complejos), el no aprovechamiento máximo del sustrato alimentado, y la alta probabilidad de contaminación y mutación que presenta el cultivo debido a las características del diseño.
El cultivo continuo ideal se ve realizado en un reactor de flujo pistón, pero los equipos en los cuales se realiza solo generan una aproximación de este, siendo un ejemplo el tanque agitado con agitación completa, el cual entrega una concentración de salida idéntica a la concentración dentro del reactor, debido a su mezclamiento teóricamente perfecto. Es por esto que para el estudio de la cinética del cultivo continuo, se utilizara la modalidad de CSTR (Continuous Stirred Tank Reactor) para un reactor biológico de 1 litro de volumen.
Para realizar el cultivo, se utilizara la bacteria Escherichia coli, ya que sus condiciones de crecimiento son fáciles de replicar a escala de laboratorio, lo que permite su correcta manipulación y crecimiento (Quiroga, 2010). Este organismo será cultivado en un reactor de 1 litro, a 37 [°C], 1 [vvm], 600 [rpm] y manteniendo el pH en un valor de 7.
2.- Materiales y Métodos
2.1.- Preparación del medio de cultivo, reactor y puesta en marcha
2.1.1 Preparación del medio de cultivo y otras sales.
Medio de cultivo
-El medio de cultivo utilizado fue el M9, con el cual se determinó la cantidad de masa de cada sal para el bidón y el reactor:
Reactivo | Concentración [gr/L] | Bidón 15 L (gr) | Reactor 1 L (gr) |
Glucosa | 4 | 60 | 4 |
MgSO4 | 0.24 | 3.6 | 0.24 |
CaCl2 | 0.11 | 1.65 | 0.11 |
Na2HPO4 | 12.84 | 192.6 | 12.84 |
KH2PO4 | 2.98 | 44.7 | 2.98 |
NaCl | 1.02 | 15.3 | 1.02 |
Tiamina | 0.005 | 0.075 | 0.005 |
-Volúmenes de soluciones a preparar:
Reactivo | Volumen preparado (ml) |
Glucosa | 500 |
MgSO4 | 25 |
CaCl2 | 25 |
Na2HPO4 | |
KH2PO4 | 500 |
NaCl | |
NaOH [2M] | 200 |
-Volúmenes a utilizar de los reactivos y concentración inicial:
Reactivo | Concentración 1 [g/L] | Volumen utilizado [mL] |
Glucosa | 200 | 20 |
MgSO4 | 12 | 20 |
CaCl2 | 1,1 | 10 |
Na2HPO4 | 15,1 | |
KH2PO4 | 3,5 | |
NH4Cl | 1,2 | 850 |
NaCl | 0,6 | |
Inoculo | 0,138 | 100 |
Volumen Total | 1000 |
2.1.2.- CALIBRACIÓN DEL ELECTRODO DE PH Y PREPARACIÓN PARA AUTOCLAVAR. |
Seleccionar las mangueras adecuadas y conectarlas a la salida de toma de muestra, la entrada de solución reguladora de pH, la entrada y salida de aire; en la entrada de aire debe ir un filtro de aire, entrada y salida de agua. Proceder a sellar cada una de estas mangueras y las otras aberturas presentes en el reactor con un trozo de algodón que deberá ser cubierto con papel metálico y sellado con cinta adhesiva. Colocar a cada manguera una abrazadera. Una vez listo lo anterior se verterá un volumen de sales (Na2HPO4, KH2PO4, NH4Cl y NaCl) de 850ml en el reactor junto a una gota de antiespumante MERK. Se deberá calibrar el electrodo de pH de la siguiente manera: Colocar primero el electrodo en una solución de pH 7 y esperar que la lectura sea constante, ir al menú y establecer dicho valor como pH=7, lavar el electrodo con agua desionizada y secarlo, realizar el mismo procedimiento anterior pero con una solución de pH=4 para finalizar con la calibración. Se deberá verificar la calibración de electrodo mediante el uso de estas mismas soluciones donde el error permisible será de 0.05 (3.95 para pH 4 y 7.05 para pH 7). Se instalaran los electrodos de pH y oxígeno previamente lavados, en este último deberá ser revisada su membrana y su nivel de electrolito, el que si no está suficientemente alto deberá ser rellenado, todo lo anterior con el uso de guantes. A Continuación se sellará el reactor a su base, y en conjunto a las otras soluciones deberán ser colocados en el autoclave. Dejar por un tiempo mínimo de 2 horas a 121°C para lograr la esterilización (considerando todos los tiempos). |
2.1.3- AMBIENTACIÓN DE SENSORES DE PH Y OXÍGENO. En esta etapa simplemente se procederá a conectar ambos sensores de pH y de oxígeno a sus medidores respectivos. Se dará un tiempo de un día debido a que los sensores tienen que estar familiarizados con la solución de sales antes de la inoculación. |
2.1.4- CALIBRACIÓN DEL ELECTRODO DE OXIGENO, INOCULACIÓN Y PUESTA EN MARCHA. |
Fijar el eje del rotor del reactor al motor. Realizar un baño termostatizado y conectarlo a las entradas y salidas de agua del reactor, una vez alcanzado los 37°C se deberá rociar con alcohol la superficie del reactor y esperar que se seque, luego prender el mechero (para mantener la zona estéril) y adicionar las soluciones restantes del medio de cultivo (Glucosa, MgSO4, CaCl2 y Tiamina). Luego se ajusta el pH a 7 adicionando NaOH 2M mediante el uso de una bomba. Fijar los rpm a 300, conectar la entrada de aire al reactor y calibrar el flujo 1 vvm, y esperar a que se estabilice la lectura. Para calibrar el electrodo ingresar a menú y a la opción CAL y esperar que el valor asignado sea de 100%, luego conectar nitrógeno a la entrada de gases y esperar que se estabilice la lectura, del mismo modo anterior calibrar hasta que el valor asignado sea de 0% (o muy cercano a este valor). Verificar la calibración igualmente con aire y nitrógeno. Finalmente se procede a la inoculación con 100ml. Se realizaran tomas de muestras previo al inicio del sistema continuo para tener una referencia. Una vez establecido el sistema continuo se trabajara con dos tasas de dilución en días distintos, que serán fijadas en el siguiente punto. Se procederán a tomar muestras de las que se medirá biomasa hasta que determinemos que el sistema se haya estabilizado. Se medirán posteriormente Glucosa y Acetato. 2.2.-MEDICION DE PARÁMETROS -Medición de Biomasa: Simplemente se tomaran las muestras extraídas y se procederá a su medición en el espectrofotómetro a 600 nm, donde si la medición esta fuera de rango (superior) se procederá a realizar su correspondiente dilución. Este valor será reemplazado en una curva patrón de biomasa previamente realizada para obtener la concentración correspondiente. -Medición de Glucosa: Se procederá a someter cada una de las muestras tomadas al método del DNS. Su fundamento está basado en que los azúcares reductores en solución alcalina se hidrolizan produciendo un compuesto colorido en solución alcalina, el que se mide a 540 nm (en este caso), dicho valor deberá ser reemplazado en su correspondiente curva patrón para arrojar un valor determinado de concentración de glucosa. Su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico (Bello et al. 2006). Si las concentraciones de glucosa a medir son muy altas (se encuentran fuera de rango) se procederá a su dilución antes de someterla al método del DNS. |
-Calibración de la Bomba de alimentación: Para calibrar la bomba simplemente fijar una rpm y con una probeta ir tomando el tiempo que tarda en llenar cierta cantidad de volumen. Testear diferentes rpm para lograr alcanzar el flujo necesario para nuestra alimentación. |
...