Los métodos para determinar la actividad de la enzima

METODOLOGIA

Las enzimas son catalizadores biológicos que actúan acelerando las reacciones químicas, permitiendo que ocurran en un tiempo adecuado. Básicamente, la enzima (E) se une al sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato [ES] donde ocurren cambios en la molécula de sustrato dando origen al producto (P), sin alterar la enzima.

E + S [ES] P + E

La actividad de una enzima se determina como la cantidad de producto formado, o de sustrato consumido, en un tiempo dado. Si se cuenta con un método específico para detectar la aparición del producto o la desaparición del sustrato, se podrá medir cuantitativamente la actividad de la enzima. Si el producto es coloreado, absorbe luz en la región visible del espectro. Así, si la concentración de producto aumenta, también aumentará la absorción de luz, Absorbancia (A) o Densidad Óptica (DO), indicando un aumento de la actividad enzimática.

Generalmente la actividad enzimática se evalúa mediante ensayos espectrofotométricos, por tanto necesitamos seguir la evolución de alguno de los elementos que participan en la reacción y que, por supuesto, deben absorber luz a una determinada longitud de onda así:

• Si el producto absorbe luz a una longitud de onda determinada podemos evaluar la aparición del producto analizando el incremento de absorbencia a dicha longitud de onda.

• Si el sustrato absorbe luz a una longitud de onda determinada podemos evaluar la desaparición del sustrato analizando la disminución de absorbencia a dicha longitud de onda.

• De igual modo podemos analizar la variación de un cofactor o de algún componente de la reacción.

En ocasiones ninguno de los elementos que participan directamente en la reacción absorben luz, en cuyo caso es necesario acoplar una segunda reacción en la que alguno de los reactivos o productos presenten un máximo de absorción. Analizando esta segunda reacción podremos evaluar la actividad enzimática de la primera.

Los métodos analíticos para determinar la actividad pueden ser:

• Métodos a punto final

• Métodos cinéticos

La actividad de una enzima se expresa en Unidades por ml (U.mL-1) que se definen como los nanomoles de producto formado por minuto por mililitro de solución (nmol.min-1.mL-1).

La relación entre la actividad de una enzima con el total de proteínas presente en una muestra se define como la actividad específica (AE). Esta es una expresión muy utilizada que nos indica la pureza relativa de la enzima en una solución, y se expresa como la actividad enzimática, en Unidades, por mgr de proteina (U.mgr-1).

DESCRIPCION DEL METODO DE ESPECTROFOTOMETRÍA

La espectrofotometría es el método de analisis optico mas usado en las investigaciones químicas y biológicas.

El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Principio de la Espectrofotometría

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que estas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

La espectrofotometria ultravioleta-visible usa haces de radiacion del espectro electromagnetico, en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800 nm , por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la region ultravioleta y visible del espectro.

Al campo de luz uv de 200 a 400 nm se le conoce también como rango de uv cercano , la espectrofotometría visible solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible , de 400 a 800 nm.

Ademas, no esta de menos mencionar el hecho de que la absorción y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentracion y de la distancia recorrida.

ESPECTROFOTOMETRO

La palabra espectrofotómetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotómetro, construido mediante

procesos avanzados de fabricación, es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de investigación desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con otras sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la sustancia

PROPÓSITO DEL EQUIPO

El espectrofotómetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentración de una sustancia en una solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos.

PRINCIPIOS DE OPERACIÓN

Como principio básico se considera que la luz es una forma de energía electromagnética, que en el vacío tiene una velocidad constante [C] y universal de aproximadamente 3 x 108m/s. En cualquier otro medio (transparente) por el que pase la luz, su velocidad será ligeramente inferior y podrá calcularse mediante la siguiente ecuación:

...