METABOLISMO DE LIPIDOS CONVERSIÓN DE GRASAS A CARBOHIDRATOS

METABOLISMO DE LIPIDOS

CONVERSIÓN DE GRASAS A CARBOHIDRATOS

INTRODUCCIÓN

• Germinación de semillas.
• Sustancias de reserva en las semillas
• Valor energético de lípidos
• Ciclo del glioxilato
• La β-oxidación
• Biosíntesis de glúcidos

OBJETIVO

• Estudiar el metabolismo y transformación de biomoléculas que ocurre en el proceso de germinación de las semillas de ajonjolí.
• Cuantificar las concentraciones de lípidos, carbohidratos y proteínas en semillas sin germinar y germinadas.
• Establecer las diferencias bioquímicas que se presentan en semillas sin germinar y germinadas.

REACTIVOS:                                                

mezcla cloroformo:metanol 2:1       Eq.40ml     Gpo.200ml (guardar en frío)

fenol^[a] al 5%                                       Eq.6ml     Gpo. 30ml (guardar en congelación)

H2SO4 concentrado                        

solución amortiguadora de fosfatos 0.1M, pH 7.5 y 3mM de MgCl2   Eq.30ml Gpo. 200ml

reactivo de Biuret                             Eq. 100ml    Gpo. 500ml

solución patrón de glucosa 0.2 mg/ml          Eq. 5ml     Gpo. 50ml  

solución patrón de caseína^[b] 20 mg/ml (caseína R. A. para fines bioquímicos, Merck) Eq. 5ml  Gpo.50ml

solución de NaCl al 1%                    Eq. 100ml      Gpo. 600ml

agua estéril (hervida y preenfriada)  

bicarbonato 10%                               Eq. 100ml      Gpo. 500ml

MATERIAL  

*material que debe ser proporcionado por el alumno

• PARTE I

• *5g de semillas de ajonjolí para germinar (no tostado ni horneado)
• *2 cajas Petri estériles
• *papel aluminio
• *solución de hipoclorito de sodio al 1% (cloro comercial 1:10 en agua)
• 2 piezas de papel filtro

• PARTE II

• Espátula
• 2 Morteros y pistilos
• 4 Tubos de centrífuga
• Hielo
• Recipiente para hielo
• 2 pipetas de 10 ml

• PARTE III

• Gradilla y 10 tubos de ensaye
• Piceta con agua destilada
• 2 pipetas de 10 ml
• Micropipeta de 1ml o jeringas de insulina
• Espectrofotómetro

• PARTE IV

• Gradilla y 11 tubos de ensaye
• Piceta con agua destilada
• 1 pipeta de 5 ml
• 1 micropipeta de 1ml o jeringas de insulina
• Espectrofotómetro

• PARTE V

• Espátula
• 2 morteros y pistilos (los mismos que se usan en la parte II)
• Hielo
• Recipiente para hielo*
• 2 vasos de precipitado de 50ml
• Pipeta de 10ml
• *Gasa
• 4 Tubos de centrífuga
• Baño maría (tripié, tela de asbesto y charola)
• 2 pipetas de 10 ml (las mismas que se usan en la parte II)
• 2 pipetas pasteur

La parte I se realiza en casa cuatro días antes de la práctica. Las partes II y V se realizan la primera sesión. Las partes III y IV la segunda sesión.

PARTE I

GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS

1. Una semana antes de la realización de la práctica pesar 4 lotes de semillas de ajonjolí de 1g cada uno y cuantificar aproximadamente la cantidad de semillas por lote.
2. Cuatro días antes de la realización de la práctica desinfectar dos lotes de semillas mezclándolas en una solución diluida de hipoclorito de sodio (cloro comercial 1:10 con agua). Enjuagar las semillas 2 veces con agua estéril.
3. Colocar cada lote de semilla en una caja Petri que contenga un disco de papel filtro humedecido, taparlos con papel aluminio (en vez del papel filtro, se puede usar una esponja de trastes nueva o un filtro para cafetera).
4. Incubarlos a 28°C durante 4 días en el sol y checar diario que esté húmedo (sin contaminar con las manos).
5. El día en que se realizará la sesión experimental (a las 8:00 a.m.) hacer el mismo procedimiento de lavado a los otros dos lotes de semillas.

        Antes de preparar los extractos, secar con papel absorbente cada uno de los lotes de semillas que se vayan a utilizar.

PARTE II

PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS

1. Tomar un lote de semillas germinadas y uno sin germinar
2. Homogenizar en un mortero las semillas germinadas y las semillas sin germinar por separado con 10ml de solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5 y MgCl2 3 mM (con el mortero preenfriado y en cama de hielo^[c])
3. Poner los homogenizados en tubos de centrífuga y equilibrarlos
4. Centrifugar a 1500 rpm durante 15 minutos
5. Pasar el sobrenadante (extracto) a otro tubo de centrífuga y etiquetarlo.^[d]
6. Anotar el volumen de extracto
7. Guardar los extractos en el congelador hasta que se utilicen

PARTE III

DETERMINACION DE PROTEINAS

• Preparar la serie de tubos como sigue:

• Agitar mezclando bien la solución en cada tubo
• Dejar reaccionar 30min
• Leer en el espectrofotómetro a 540nm

PARTE IV

DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS

• Preparar la serie de tubos como sigue:

• Agitar los tubos en el vortex

• Agitar los tubos en el vortex

¡¡¡El siguiente paso se realiza en la campana de extracción!!!

• PRECAUCIÓN: Agitar suavemente porque la reacción es exotérmica y la temperatura puede aumentar hasta 110°C
• Dejar reposar hasta que enfríe (aproximadamente 15min)
• Vortexear nuevamente
• Leer en el espectrofotómetro a 485nm

Para desechar esta solución con gran cantidad de ácido sulfúrico éste se debe neutralizar con bicarbonato 10%.

PARTE V

DETERMINACION DE LÍPIDOS

1. Tomar los otros dos lotes de semillas (germinadas y sin germinar) y secarlos bien^[g]
2. Lavar y secar perfectamente dos vasos de precipitado de 50ml y pesarlos
3. Pasar cada grupo de semillas por separado a un mortero para macerarlas con 10ml de mezcla de cloroformo:metanol ^[h]preenfriada^[i] 
4. Filtrar el macerado a través de tres capas de gasa y transferir el filtrado a tubos de centrífuga previamente marcados
5. Volver a macerar las semillas con 5ml de cloroformo:metanol y pasarlo por la gasa y ponerlo en su respectivo tubo de centrífuga
6. Equilibrar los tubos
7. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos
8. Se deben formar 4 fases: pellet, fase inferior acuosa, interfase y fase superior acuosa. Obtener la fase inferior acuosa (fase clorofórmica) utilizando con mucho cuidado una pipeta pasteur^[j].
9. Pasar la fase clorofórmica a sus respectivos vasos y eliminar los solventes por evaporación al calentarlos en baño maría.
10. Secar por fuera y pesar los vasos.
11. Restar el peso inicial y el final de los vasos, y la diferencia es la cantidad de lípidos en cada lote de semillas.

RESULTADOS

1. Graficar absorbancia vs. mg de proteína y obtener lo siguiente:

1. Pendiente, ecuación de la recta y ordenada al origen (tomar en cuenta diluciones)
2. Calcular lo siguiente para cada lote de semillas (germinados y sin germinar)

Miligramos de proteína/ml de extracto

Miligramo de proteína/gramo de semillas

Miligramos de proteína/semilla

1. Graficar absorbancia vs. mg de carbohidratos y obtener lo siguiente:

1. Pendiente, ecuación de la recta y ordenada al origen
2. Calcular lo siguiente para cada lote de semillas (germinados y sin germinar)

Microgramos de carbohidratos/ml de extracto

Microgramos de carbohidratos/gramos de semilla

Microgramos de carbohidratos/semilla

1. Calcular por diferencia de peso

        Miligramos de lípidos/gramo de semilla

     Miligramos de lípidos/semilla

1. Completar la siguiente tabla:

1. Comparar los resultados obtenidos en los lotes de semillas germinadas contra los obtenidos en los lotes de semillas sin germinar.

CUESTIONARIO

1. Describa el proceso de conversión de ácidos grasos a carbohidratos en plantas
2. Realice un diagrama y mencione los pasos más importantes de esta transformación
3. ¿Cuales son las enzimas que intervienen en la conversión de los ácidos grasos a carbohidratos en el ciclo del glioxilato?
4. ¿En que compartimentos subcelulares se lleva a cabo la transformación de grasas a carbohidratos?
5. ¿Para que utilizan la glucosa y los ácidos grasos el embrión de las semillas durante el proceso de germinación?

Referencias

1. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega. 2005.
2. Theodoulou FL, Eastmond PJ. Seed storage oil catabolism: a story of give and take. Curr Opin Plant Biol. 2012.15:322-328.

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