Metabolismo Microbiano

Práctica No. 7 Metabolismo microbiano

Objetivo: Identificar especies bacterianas a través de su metabolismo, apoyándose en la aplicación e interpretación de pruebas bioquímicas.

Introducción

Para que una célula viva se desarrolle y reproduzca debe ser capaz de efectuar gran número de cambios químicos, poder modificar los nutrientes del medio en que vive antes de que entren en ella y hacer transformaciones adicionales una vez que aquéllos penetran. Algunos de los materiales son luego asimilados y pasan a formar parte de la célula mientras que otros, son descompuestos para obtener la energía que se requiere para la síntesis. Estos cambios tan complicados son efectuados por las enzimas, sustancias de origen proteico que se encuentran en las células en cantidades pequeñísimas y que pueden llevar a cabo todos los cambios que se asocian al proceso de la vida. Se les considera la parte activa de la célula.

Existen algunas sustancias, tanto orgánicas como inorgánicas que, en pequeñas cantidades, tienen la capacidad de acelerar las reacciones químicas sin que se alteren ellas mismas después de la reacción; simplemente aceleran la velocidad hasta alcanzar el equilibrio de esta última sin que necesariamente la inicien. Las sustancias que se comportan así se llaman catalizadores o agentes catalíticos. Las enzimas pertenecen a esta categoría ya que funcionan como catalizadores del tipo orgánico y son producidas por los organismos vivos. De esta manera, se puede definir a la enzima como el agente catalítico orgánico producido por las células vivas.

El conocimiento de las actividades bioquímicos o bioquímicas potenciales de un cultivo microbiano tiene muchas aplicaciones en Biología, se emplea para la clasificación y diferenciación de los microorganismos.

Algunos microorganismos producen enzimas capaces de romper grandes y complejas moléculas de polisacáridos (carbohidrasas), proteínas (proteasas) o lípidos (lipasas).Cuando los organismos creen en medio que contienen uno de estos sustratos puede ponerse de manifiesto su degradación debida a la presencia de enzimas.

La identificación de las Enterobacterias, que forman parte de la microbiota del intestino (Coliformes) se apoya en los procesos bioquímicos que estas bacterias realizan, considerando la definición que describe a esta familia:

Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos.

No son exigentes, son de fácil cultivo.

Son capaces de reducir nitrato en nitrito.

Son anaeróbicos facultativos.

No formadores de esporas

Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa)

Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no son móviles.

Los géneros más representativos de esta familia son:

Escherichia

Salmonella

Shigella

Yersinia

Enterobacter

Klebsiella

Proteus

Citrobacter

Serratia

Las pruebas bioquímicas que utilizaremos para la identificación de Enterobacterias de interés –Escherichia y Salmonella- y son las siguientes:

Caldo Urea

Principio: determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos moléculas de amoníaco por acción de la enzima ureasa.

Escherichia coli es ureasa negativa (no posee la enzima ureasa)

Bases bioquímicas: el sustrato urea es una diamida del ácido carbónico, a la que frecuentemente se menciona como carbamida. Todas las amidas (RCO-NH2) son rápidamente hidrolizadas. La hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica, la ureasa, para dar dos moléculas de amoníaco (base de Lewis). En solución, la urea se hidroliza dando carbonato de amonio como producto final.

La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposición de los compuestos orgánicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en constitutivas (son producidas por las bacterias sin tener en cuenta la presencia o ausencia de su sustrato, la urea) o adaptativas (son producidas solamente cuando se encuentra presente su sustrato específico). La Ureasa es considerada una enzima constitutiva, es una amidasa porque cataliza la hidrólisis de las amidas, rompe enlaces de unión entre carbono y nitrógeno.

NH2

C=O + 2HOH CO2 + H2O + 2NH3

NH2

Interpretación de resultados: una reacción positiva se observa de color rojo rosado intenso en todo el caldo, esto debido al indicador rojo de fenol que contiene el medio (ácido: color amarillo, alcalino: color rojo rosado). Una prueba negativa no produce cambio de color del caldo (amarillo paja como es el color original).

Oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua.

El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.

Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar a los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

Realización de la prueba: Método indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aprox. en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas de reactivo de Kovacs en el centro del papel.

Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.

Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso. La reacciòn positiva se produce a los 5-10 segundos.

Caldo Rojo de Metilo-Voges Proskauer

Principio: Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa, y vencer la capacidad amortiguadora del sistema.

Escherichia coli da un resultado positivo a esta prueba.

Bases bioquímicas: la prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador del pH, rojo de metilo, para determinar la concentración de iones hidrógeno (pH) presente cuando un organismo fermenta la glucosa.

Todos los Coliformes, por definición fermentan la glucosa produciendo después de 18 a 24 h de incubación, productos secundaros metabólicos ácidos, por lo tanto todos los Coliformes darán una reacción positiva con el rojo de metilo.

Sin embargo, después de más tiempo de incubación como lo exige la realización de la prueba (2 a 5 días), aquellos organismos que son rojo de metilo positivos continúan produciendo más ácidos y dan como resultado un bajo pH terminal, venciendo al sistema amortiguador de fosfato, y manteniendo un medio ácido (pH: 4.2 o menos).

Los organismos rojo de metilo negativos continúan metabolizando los productos iniciales de la fermentación (decarboxilación) produciendo un pH neutro, lo que ocasiona que se eleve el pH terminal y disminuye la acides del medio (pH: 6 o más).

Reacción general del metabolismo de la glucosa por la Escherichia coli (rojo de metilo positivo)

2 glucosa + H2O 2 ácido láctico + ácido acético + ácido fórmico + alcohol etílico + 2 CO2 + 2H2

(Ácido fórmico H2 + CO2

Los organismos denominados Rojo de metilo (-) también producen ácidos (acético, láctico y fórmico), pero tienen una menor concentración de iones hidrógeno porque hay una reversión hacia la neutralidad debida a la nueva degradación de los ácidos orgánicos en carbonatos y a la formación de amonio debido a las proteínas que se encuentran en el medio.

Además, por debajo de pH por debajo de 6.3 el ácido acético es convertido 2,3 butanodiol, productos finales neutros; por lo tanto cesa la producción de H2 mientras que aumenta la acumulación de CO2.

La validez de la prueba del rojo de metilo depende de un tiempo de incubación suficiente como para permitir que se produzca la diferencia en el metabolismo de la glucosa. Los organismos en estudio se incubarán por lo menos 2 días a 35-37°C lo que permite que todos los organismos con baja proporción gaseosa (RM +) muestran su límite en la concentración de iones hidrógeno (bajo pH terminal), mientras que los que tienen una alta relación gaseosa (RM - ) mostrarán una menor concentración de hidrogeniones (alto pH terminal).

Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 35°C durante un periodo de 3 días como mínimo y 5 como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.

Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.

Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:

0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5%

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