Metabolismo Microbiano

Práctica No. 7 Metabolismo microbiano

Objetivo: Identificar especies bacterianas a través de su metabolismo, apoyándose en la aplicación e interpretación de pruebas bioquímicas.

Introducción

Para que una célula viva se desarrolle y reproduzca debe ser capaz de efectuar gran número de cambios químicos, poder modificar los nutrientes del medio en que vive antes de que entren en ella y hacer transformaciones adicionales una vez que aquéllos penetran. Algunos de los materiales son luego asimilados y pasan a formar parte de la célula mientras que otros, son descompuestos para obtener la energía que se requiere para la síntesis. Estos cambios tan complicados son efectuados por las enzimas, sustancias de origen proteico que se encuentran en las células en cantidades pequeñísimas y que pueden llevar a cabo todos los cambios que se asocian al proceso de la vida. Se les considera la parte activa de la célula.

Existen algunas sustancias, tanto orgánicas como inorgánicas que, en pequeñas cantidades, tienen la capacidad de acelerar las reacciones químicas sin que se alteren ellas mismas después de la reacción; simplemente aceleran la velocidad hasta alcanzar el equilibrio de esta última sin que necesariamente la inicien. Las sustancias que se comportan así se llaman catalizadores o agentes catalíticos. Las enzimas pertenecen a esta categoría ya que funcionan como catalizadores del tipo orgánico y son producidas por los organismos vivos. De esta manera, se puede definir a la enzima como el agente catalítico orgánico producido por las células vivas.

El conocimiento de las actividades bioquímicos o bioquímicas potenciales de un cultivo microbiano tiene muchas aplicaciones en Biología, se emplea para la clasificación y diferenciación de los microorganismos.

Algunos microorganismos producen enzimas capaces de romper grandes y complejas moléculas de polisacáridos (carbohidrasas), proteínas (proteasas) o lípidos (lipasas).Cuando los organismos creen en medio que contienen uno de estos sustratos puede ponerse de manifiesto su degradación debida a la presencia de enzimas.

La identificación de las Enterobacterias, que forman parte de la microbiota del intestino (Coliformes) se apoya en los procesos bioquímicos que estas bacterias realizan, considerando la definición que describe a esta familia:

Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos.

No son exigentes, son de fácil cultivo.

Son capaces de reducir nitrato en nitrito.

Son anaeróbicos facultativos.

No formadores de esporas

Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa)

Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no son móviles.

Los géneros más representativos de esta familia son:

Escherichia

Salmonella

Shigella

Yersinia

Enterobacter

Klebsiella

Proteus

Citrobacter

Serratia

Las pruebas bioquímicas que utilizaremos para la identificación de Enterobacterias de interés –Escherichia y Salmonella- y son las siguientes:

Caldo Urea

Principio: determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea, formando dos moléculas de amoníaco por acción de la enzima ureasa.

Escherichia coli es ureasa negativa (no posee la enzima ureasa)

Bases bioquímicas: el sustrato urea es una diamida del ácido carbónico, a la que frecuentemente se menciona como carbamida. Todas las amidas (RCO-NH2) son rápidamente hidrolizadas. La hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica, la ureasa, para dar dos moléculas de amoníaco (base de Lewis). En solución, la urea se hidroliza dando carbonato de amonio como producto final.

La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposición de los compuestos orgánicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en constitutivas (son producidas por las bacterias sin tener en cuenta la presencia o ausencia de su sustrato, la urea) o adaptativas (son producidas solamente cuando se encuentra presente su sustrato específico). La Ureasa es considerada una enzima constitutiva, es una amidasa porque cataliza la hidrólisis de las amidas, rompe enlaces de unión entre carbono y nitrógeno.

NH2

C=O + 2HOH CO2 + H2O + 2NH3

NH2

Interpretación de resultados: una reacción positiva se observa de color rojo rosado intenso en todo el caldo, esto debido al indicador rojo de fenol que contiene el medio (ácido: color amarillo, alcalino: color rojo rosado). Una prueba negativa no produce cambio de color del caldo (amarillo paja como es el color original).

Oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua.

El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.

Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar a los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

Realización de la prueba: Método indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aprox. en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas de reactivo de Kovacs en el centro del papel.

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