Aislamiento de DNA plasmídico

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INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas pequeñas de DNA circular (entre dos y varios cientos de kilobases) que se replican de forma autónoma e independiente del cromosoma de la célula. Son muy comunes en bacterias y algunos de ellos, los más pequeños, existen en las células bacterianas en un número elevado (hasta 100 copias por células). Los plásmidos son una herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se pueden usar como "vectores" para introducir en ellos cualquier fragmento de DNA de interés y, de esta forma, amplificarlo de forma natural dentro de la bacteria en la que el plásmido se replica.

Se han desarrollado un gran número de métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos ellos implican invariablemente tres pasos:

1. Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora en medio de cultivo
2. Recogida y lisis de las bacterias
3. Purificación del DNA plasmídico

El método utilizado para la obtención de plásmido en esta práctica se denomina lisis alcalina y se basa en la desnaturalización selectiva del DNA cromosómico.

OBJETIVOS

• Aislar DNA plasmídico bacteriano, comprobando dicho aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa.

RESULTADOS

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ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El método utilizado para el aislamiento del plásmido PUC-19 que se encontraba en una bacteria (Escherichia coli) fue por lisis alcalina.

Este método explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el DNA plasmídico (pequeños círculos de DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosómico (fragmentado).

Contábamos con una solución de 1 x 107 bacterias a la cual se agregaron 100 µL de la solución I (Solución GTE), al contener una alta concentración de sales que regulan el pH de la solución que aproximadamente se encontraba en 7.8, la presencia de glucosa impide que la membrana celular se rompa bruscamente por mantener la presión osmótica de la célula y EDTA (ácido etilendiamino tetracético). Este último es un agente quelante de calcio; es decir                                  atrapa el medio de los cationes que actúan como cofactores de las endonucleasa, por tanto protege al DNA de la acción de las enzimas que lo degradan.

Transcurridos 5 minutos se agregaron 200 µL de la   solución II (SDS 1%-NaOH 0.2N), la cual provoco varias reacciones químicas; por un lado el SDS es un detergente que disuelve la membrana celular abriendo huecos por los que puede salir de manera controlada el DNA plasmídico, mientras que el DNA cromosomal no lo puede hacer debido a su gran tamaño. El detergente SDS también se encarga de desnaturalizar proteínas con lo cual es una forma de proteger el DNA de posibles acciones de endonucleasa. Por otro lado la adición de NaOH hace que aumente el pH hasta un punto en el que el DNA se desnaturaliza separándose las dos hebras que lo forman, esto le sucede tanto al DNA cromosomal como al plasmídico, pero en este último, a diferencia del genómico, no sufre una separación  total gracias a su topología.  

En este punto la muestra se observó viscosa, esto debido a que todos los restos celulares se disolvieron por acción del detergente.                  

Cuando a esta solución se agregó 150 µL de la solución III (acetato de potasio, ácido acético glacial), el ADN desnaturalizado (cromosomal) forma un agregado junto con el SDS y las proteínas bacterianas, el cual precipita por acción del potasio; mientras que el DNA plasmídico se mantiene en solución. Por otro lado el ácido acético logra neutralizar el pH del medio recuperando el DNA plasmídico su forma nativa; esto debido a que a no perdió totalmente su estructura ya que las dos hebras nunca llegaron a separarse. La separación del agregado de restos celulares, proteínas y DNA logra mediante centrifugación.

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