Purificacion Adn Plasmidico

39. Aislamiento y purificación del DNA de un

plásmido recombinante

Aurora Galván Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, José

Javier Higuera, Vicente Mariscal, Emilio Fernández Reyes

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,

Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

El DNA de un plásmido recombinante presente en una bacteria se aísla

por un método rápido y sencillo (“miniprep”) que consiste en lisis

bacteriana, precipitación de proteínas y DNA genómico, y finalmente

precipitación del DNA plasmídico. El objetivo es obtener suficiente

cantidad del DNA para su análisis posterior mediante electroforesis.

Palabras clave: DNA plasmídico, lisis alcalina, eficiencia de la purificación

Abreviaturas empleadas. DNA: ácido desoxirribonucleico; IPTG, isopropil-β-Dtiogalactopiranósido; LB: medio de Luria-Bertani; RNasa, Ribonucleasa.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y

generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies

bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA

cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesarios para la

viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a

la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia

a antibióticos, a metales etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la

propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en

forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento

y purificación.

Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno

de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un

sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de

DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y

expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con

el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de

vector recombinante.

Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer

al menos tres características: 1) Debe tener su propio origen de replicación y

por tanto la capacidad de replicación autónoma independiente del genoma del

hospedador. 2) Debe tener sitios de clonación múltiple que permitan la apertura

del DNA con enzimas de restricción y hace posible la clonación de insertos de

1 DNA en la forma y orientación determinada. 3) Debe poseer marcadores

genéticos seleccionables que permitan aislar las células hospedadores que

contengan el vector. La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas

estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha

consistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una

misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales.

La presencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina permite

seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad

para crecer en presencia de dicho antibiótico (el gen de resistencia codifica una

beta lactamasa, enzima que degrada la ampicilina).

La mayoría de los plásmidos usados en Biologia Molecular contienen el sitio

de clonación múltiple dentro el gen de la β-galactosidasa lo que permite la

interrupción e inactivación de este gen cuando

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