Aislamiento de DNA Plasmídico.

Instituto Politécnico Nacional.[pic 1]

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
Químico Farmacéutico Industrial.

Laboratorio de Bioquímica General.

[pic 2]

Alumnos:
Campos Rojas Juan Isaac

García Torres Rebeca Del Rosario.
Sección: 2           Grupo: 3FV1

Práctica 14: Aislamiento de DNA Plasmídico.

Introducción:
Las moléculas intactas de cultivos bacterianos nativos, debido a su tamaño son difíciles de aislar, la mayoría de las células bacterianas contienen más de 1 a 20 moléculas de DNA más pequeñas denominadas, plásmidos, se replican en números fijos junto con los cromosomas, sus funciones no son conocidas claramente, pero algunos de ellos llamados episomas se incorporan al cromosoma de la célula huésped. Los plásmidos pueden ser transmitidos de una célula bacteriana a otra durante la conjugación sexuada, confiriendo así nuevas características fenotípicas a la célula recipiendaria.

Objetivos:

• Aislar DNA plasmídico bacteriano, comprobando dicho aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa.

Resultados:

Figura 1. Resultados obtenidos en la electroforesis grupal.

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Figura 2. Resultados obtenidos en la electroforesis grupal  visto con luz ultravioleta.

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Nuestro plásmido corrió en el carril 6, observando que el plásmido no se rompió y perduró en forma súper enrollada, se observa un desplazamiento correcto y no observa barrido.

Discusión:

En la práctica nos proporcionaron las bacterias incubadas en un tubo eppendorf en baño de hielo.

Adicionamos la solución I que contiene la solución GTE (Glucosa Tris EDTA) para atrapar a los iones y no permitir que ataquen a las DNAsas e incubamos en hielo para que las células re suspendidas mueran.

Después le adicionamos la solución II que contiene SDS y NaOH para romper la membrana y liberar su contenido celular e incubamos nuevamente. Agregamos la solución III que contiene acetato de potasio para provocar el DNA genómico precipitara por su alto peso molecular al igual que algunas proteínas, incubamos en hielo por determinado tiempo y centrifugamos, vertimos el sobrenadante en otro tubo eppendorf que contenía nuestro plásmido y el precipitado son las proteínas que procedemos a desechar.

Después al sobrenadante le agregamos la  solución IV que contiene isopropanol para que el plásmido precipite, ya que no es soluble en alcohol, incubamos y centrifugamos nuevamente, desechamos nuestro sobrenadante cuidando de to agitar el tubo para que nuestro plásmido no se despegue y no se vuelva a re suspender con el sobrenadante que haya quedado.

La cámara de electroforesis junto con el pozo de gel  lo preparó la profesora así que procedimos a agregar la solución V que contiene el regulador tris-EDTA para disolver el plásmido y colocar una pequeña muestra a un carril del pozo y esperamos a que se llevara a cabo la electroforesis por 30 min. Después   revelamos con bromuro de etidio para que se intercalen en nuestra muestra el DNA, para esto se necesita la luz ultravioleta.

El plásmido puede presentarse de tres formas, estas pueden ser súper enrollada que se desplazará más rápido en la electroforesis por lo que estará al final, lineal que se encuentra arriba de está dando un desplazamiento regular y circular relajada no tendrá un buen desplazamiento  por lo que se queda cerca del pozo, si la placa se ve barrido quiere decir que se hidrolizó. Analizando nuestro carril de la placa de las figuras 1y 2, nuestro plásmido logró desplazarse correctamente esperando que el plásmido esté de forma súper enrollado.

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