Mezclas de ligación La política de contención y su aplicación en Latinoamérica

Transforma tus mezclas de ligación en una cepa competente de E. coli recA, endA

(por ejemplo, TOP10, DH5α ™, JM109) y seleccionar en placas de agar con bajo contenido de sal LB que contienen 25 μg / ml de Zeocin ™ (ver a continuación). Tenga en cuenta que no hay detección azul / blanca de la presencia de inserción con pPICZα A, B o C. Una vez que haya obtenido las colonias resistentes a Zeocin ™, elija 10 transformantes y seleccione la presencia y orientación de su inserción.

Para facilitar la selección de E. coli resistente a Zeocin ™, la concentración de sal del

el medio debe permanecer bajo (<90 mM) y el pH debe ser 7.5. Prepare Low Salt

LB caldo y platos usando la receta en el Apéndice, página 17. Si no se reduce el contenido de sal de su medio LB, no se seleccionará debido a la inhibición del medicamento.

Recomendamos que secuencia su construcción para confirmar que su gen está en la orientación correcta para la expresión y clonado en marco con la secuencia señal del factor α y el péptido C-terminal. Para facilitar la secuencia, el Imprimador de Pichia 3 AOX1 (Nº de catálogo N720-02) y el Primer de Pichia 5 AOX1 (Nº de catálogo N710-02) están disponibles por separado de Invitrogen. Consulte los diagramas en las páginas 5-7 para las secuencias y la ubicación de los sitios de cebado.

Una vez que haya identificado el clon correcto, asegúrese de purificar la colonia y hacer un stock de glicerol para el almacenamiento a largo plazo. También es una buena idea mantener un stock de ADN de su plásmido a -20 ° C.

1. Distribuya la colonia original en una placa Low Salt LB que contenga 25 μg / ml de Zeocin ™. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche.

2. Aislar una sola colonia e inocular en 1-2 ml de Low Salt LB que contiene 25 μg / ml de Zeocin ™.

3. Crezca el cultivo a la fase de registro medio (OD600 = 0.5-0.7).

4. Mezcle 0,85 ml de cultivo con 0,15 ml de glicerol estéril y transfiera a un criovial.

Almacenar a -80 ° C.

Una vez que haya clonado y secuenciado su inserto, genere suficiente ADN plásmido para transformar Pichia (5-10 μg de cada plásmido por transformación). Recomendamos aislar ADN plasmídico utilizando los kits mini o midiprep S.N.A.P. ™, los kits mini o midiprep PureLink ™ HiPure Plasmid o la centrifugación en gradiente CsCl (consulte la página viii para obtener información sobre pedidos). Una vez que haya purificado el ADN del plásmido, proceda con la Transformación de Pichia, página siguiente.

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