Micropipeteo y carga en pocillos

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PRÁCTICA 1: MICROPIPETEO Y CARGA EN POCILLOS

FUNDAMENTO

En los laboratorios de Biología Molecular, el manejo del equipo básico es fundamental. Además, se requiere del conocimiento de las distintas unidades de medición y su correcta conversión, ya que dichos procedimientos se utilizan a diario en distintas labores relacionadas con el trabajo.

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Las dos medidas más usadas en biología molecular son el microlitro (μL) y el mililitro (mL), 1 mL = 10-3 L y un 1 μL = 10-6 L.

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a) Precauciones en el uso de las micropipetas automáticas:

• Nunca rotar el ajustador de volumen más allá del límite superior o inferior de la pipeta indicados por el fabricante.
• Nunca usar la micropipeta sin colocar antes una punta; hacer esto puede dañar el pistón de precisión que mide el volumen del líquido.
• Nunca colocar horizontalmente la pipeta con una punta llena con líquido; éste puede escurrirse hacia el pistón.
• Nunca soltar de forma brusca el émbolo después de tomar o vaciar el líquido; esto puede dañar el pistón.
• Nunca sumergir el barril de la pipeta en el líquido.
• Nunca flamear la punta de la pipeta (es de plástico).

b) Instrucciones para el pipeteo:

1. Girar el ajustador de volumen hasta alcanzar la cantidad deseada. Notar el cambio en la longitud del émbolo conforme se cambia el volumen. Asegúrese de localizar la posición del punto decimal al leer el volumen en la pipeta.

2. Colocar la punta del tamaño adecuado firmemente en el extremo de la pipeta.

3. Al verter o sacar el líquido, sostener el tubo firmemente entre el pulgar y el índice, a nivel del ojo, para poder ver el cambio en el volumen en la punta de la pipeta. No pipetear con el tubo descansando en la gradilla o mientras es sostenido por otra persona.

4. Sujetar el tubo por su cuerpo, no por la orilla ni el tapón, esto permite un mayor control y evita la contaminación de las manos y de los líquidos que se manipulan.

5. Al llenar la pipeta, sostenerla lo más vertical posible.

6. La mayoría de las micropipetas tiene un pistón de dos posiciones, con un punto de fricción entre uno y el otro. Prestar atención a este punto y practicar las posiciones

7. Para tomar la muestra del tubo con el reactivo:

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• Sumergir la punta de la pipeta en el líquido unos 2 o 3 mm, bajar el émbolo hasta la primera posición y liberar gradualmente el émbolo de la primera posición, dejando la pipeta unos dos segundos sumergida para permitir la correcta succión del líquido.
• Sacar la punta de la pipeta deslizándola por la pared del tubo, para eliminar cualquier exceso que se haya adherido a la parte externa de la punta.
• Revisar que no haya quedado ninguna burbuja dentro de la punta. Para evitar futuros errores de pipeteo, aprender a reconocer el nivel aproximado al cual se llena la punta, con un volumen dado.

8. Para expulsar la muestra en un recipiente:

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• Bajar la punta de la pipeta hasta que toque el fondo del recipiente formando un ángulo de 30-45 °. Esto crea un efecto capilar que ayuda a liberar el líquido.
• Lentamente, bajar el émbolo hasta la primera posición para expulsar la muestra, manteniendo el émbolo en dicha posición.
• A continuación seguir bajando el émbolo hasta la segunda posición, para vaciar completamente su contenido a la vez que se arrastra la pipeta por las paredes del recipiente unos 10 mm. Mantener el émbolo en esta posición.
• Retirar la pipeta del recipiente. Después, liberar lentamente el émbolo.
• Expulsar la punta de la pipeta usando el expulsor de puntas.

MATERIALES (completa indicando el material utilizado en la práctica)

Balanza analítica

Guantes

Vasos de precipitado

Papel absorbente

Pipeta

Micropipeta y puntas

Papel de filtro

Gelatina comercial

Agua destilada

Azul de bromofenol

Cubetas

Peines de diferentes grosores

Gomillas

Pinzas

Separadores

Termómetro

Microondas

Varilla de vidrio

PROCEDIMIENTO

Pipeteo de volúmenes pequeños:

1. Rotular tres tubos de 1,5 mL con A, B y C.

2. Usar la siguiente matriz como guía para añadir las distintas soluciones a cada tubo:

3. Con una misma punta azul, añadir la solución I a cada tubo.

4. Use una punta nueva para añadir la solución II a los tubos.

5. Use una punta nueva para agregar 2 μL de la solución III a los tubos A y C.

6. Use una punta nueva para agregar 2 μL de la solución IV a los tubos B y C.

7. Tapar los tubos. Mezclar los reactivos ya sea golpeando los tubos contra la mesa para bajar todas las gotas que haya en la pared del tubo, con vórtex o colocándolos en una microcentrífuga y aplicando un pulso corto de varios segundos (asegurarse de que los tubos estén balanceados en el rotor).

 8. Un total de 200 μL fue añadido a cada tubo. Para revisar la exactitud de sus mediciones, fije la pipeta en 200 μL y extraiga cuidadosamente la solución de cada tubo.

Verifique si ocurrió alguna de estas situaciones:

• ¿La punta se llenó correctamente? No, en ningún caso. En el, tubo A la punta no se llenó completamente porque había una burbuja. En el B nos sobró agua y en el C salía una pequeña burbuja
• ¿Quedó una pequeña cantidad de la solución en el tubo? Sí, en el tubo B
• Después de extraer todo el líquido, ¿quedó un espacio de aire en la punta? Si ocurre esto, mueva el ajustador de volumen hasta sacar la burbuja de la punta y lea el volumen final cargado.

Calibración de micropipetas:

Seleccionamos una pipeta y la vamos a calibrar en tres volúmenes diferentes. Para ello de cada volumen haremos diez pipeteos y mediremos las masas de agua en balanza analítica.

Conversión de masa a volumen

V= ( w + e ) x Z

V= volumen (mL)
w=peso (weight) (mg)
e= perdida por evaporación (mg)
z= factor de conversión para mg/mL

Nota: La pérdida por evaporación puede ser significante con pequeños volúmenes. Para determinar la pérdida de masa, dispensar agua en el recipiente de pesado, tomar nota de la lectura y empezar a tomar el tiempo con un cronómetro. Comprobar cuanto decrece la lectura en 30 segundos. Comparar esto con el tiempo de pipeteo.

Normalmente, la duración de un pipeteo son 10 segundos y las masa perdida 2 μg. Si se usa una trampa de evaporación o una tapa, no es necesario realizar la corrección de evaporación.

Exactitud: Error Sistemático

La exactitud es la diferencia entre el volumen dispensado y el seleccionado en una pipeta

A= [pic 6]  -VS

A=Exactitud (accuracy)
[pic 7] =Volumen-medio
Vs=volumen-seleccionado
En un certificado de calibración la exactitud se expresa como un valor relativo
ACC%= 100% x A/Vs

La precisión se refiere a la repetitibilidad de los pipeteos. Se expresa como desviación estándar (s) o coeficiente de variación (cv). Además de por la propia pipeta, la práctica en el laboratorio, y la experiencia del usuario son también factores importantes que afectan a la precisión.

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