PRÁCTICA NÚM. 2 SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

PRÁCTICA NÚM. 2

SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

PROPÓSITO

Al finalizar la práctica el alumno comprobará que la cromatografía en capa fina es una técnica que se utiliza para la separación de fosfolípidos de la yema del huevo.

TIEMPO DE REALIZACIÓN: Cuatro horas

MARCO TEORICO

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes que se han de separar, se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria), mientras que la otra fase (fase móvil) se mueve en una dirección definida.

Funciones:

-determinar el grado de pureza de un compuesto.

-comparar muestras.

-realizar el seguimiento de una reacción.

Mecanismo:

-depositar la muestra a analizar cerca de un extremo de una lamina de plástico a aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de absorbente.

-la lamina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados.

-a medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes entre el disolvente y el adsorbente.

-adsorbentes: fase estacionaria, mas ampliamente utilizadas son la gel de sílice y la alumina, ambas de carácter polar. El proceso de adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo-dipolo o enlaces de Hidrogeno entre el soluto y el adsorbente, que debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como un catalizador en reacciones de descomposición.

-eluyentes: su función es incrementar el compuesto al aumentar la polaridad de la fase móvil. Se caracterizan por tener bajos puntos de ebullición y viscosidad, lo que permite que se muevan con rapidez. Usualmente se emplea una mezcla de dos disolventes en proporción variable; la polaridad de la mezcla será el valor promediado en función de la cantidad de cada disolvente empleado.

-determinación del Rf:

-la retención se puede explicar en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar y la fase móvil por adsorberse a los centros activos polares de la fase estacionaria.

-la retención y la selectividad en la separación dependen de los valores respectivos de las constantes de los diferentes, equilibrios químicos que tienen lugar en la función de: a) polaridad del compuesto y b) naturaleza del disolvente.

-la distancia recorrida por el soluto y por el eluyente desde del origen de la placa se conoce como Rf y tiene el valor constante para cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas.

-calculado de la siguiente manera:

R=[pic 1]

x=distancia recorrida por el compuesto

y= distancia recorrida por el eluyente

La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la muestra.

-Revelado de las placas: el indicador absorbe la luz UV y emite luz visible, la presencia de un compuesto activo en el indicador absorba la luz de la zona en la que se encuentra el producto y el resultado de la visualización de una mancha en la placa que indica la presencia de un compuesto.

-fosfolipidos: aquellos que tienen acido fosfórico en su composición, se encuentran en las membranas activas de las células y son relevantes para el organismo. Son anfipaticos.

-Lipidos y valor nutricional presentes en la yema de huevo: huevo contiene aproximadamente un 11% de fracción grasa depositada exclusivamente en la yema, (66% de tigliceridos, 28% fosfolipidos, 5% de colesterol). El huevo ejerce un papel en la terapia y prevención de enfermedades crónicas e infecciones, potente actividad antibacteriana y antivírica, inmonuvoladores y anticancerigenas.

Energía 71kcal, carbohidratos 0.34 g, y viramina 60.06 mg.  

BIBLIOGRAFIA:

biomodel.uah.es-tecnicas-crom-inicio

https://www.unam.es-actuales-guion-p6

https://definicion.de-fosfolipidos

https://albeitar.portal.veterinario.com-el-huevo

MATERIAL Y REACTIVOS

PROCEDIMIENTO

Primera parte: Extracción de lípidos

1. Separar la yema del huevo y mezclarla con 30 mL de la solución de cloroformo-metanol 2:1 para extraer fosfolípidos y lípidos neutros.
2. Agitar aproximadamente 20 minutos.
3. Filtrar, agitar el filtrado claro con 20 mL de la solución de cloruro de potasio 0.1M.
4. Centrifugar a 2000 rpm, por 20 minutos.
5. Separar la fase acuosa superior y usar la fase clorofórmica inferior para la cromatografía.

Segunda parte: Cromatografía en capa fina

1. Aplicar tres muestras del extracto de lípidos aproximadamente de 30 microlitros en forma equidistante.
2. Colocar el cromatograma en la cámara saturada con el eluyente.
3. Dejar desarrollar durante 90 minutos o hasta que alcance una altura de 12-15 cm.
4. Sacar la placa de la cámara y dejar secar.

Tercera parte: Revelado de cromatogramas

Revelar cada placa cromatográfica con un revelador distinto con el fin de obtener las manchas características de cada tipo de fosfolípidos.

NOTA: El cromatograma revelado con el reactivo de ninhidrina requiere calentarse a 100oC por 5 minutos.

RESULTADOS

Dibujar un esquema a escala de los cromatogramas revelados, resaltando las manchas que se hayan identificado. Calcular los RF de cada una de las manchas detectadas e identificar los compuestos correspondientes.

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