Practica bioquimica. Cromatografia en capa fina

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Introduccion

Las proteínas son elementos vitales para los organismos, encontrándose en plantas y animales en una proporción elevada. Hay una gran variedad de proteínas y cada una desempeña una función biológica específica que puede ser de reserva, de sostén, transporte, estructural, etc.

Químicamente las proteínas están constituidas por combinaciones complejas de carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrógeno y otros elementos en menor proporción como son azufre cobre y fosforo, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua soluciones coloidales que pueden precipitar, formándose coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a 70oC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desorganizan, por destrucción de sus estructuras secundaria y terciaria. Esto trae como consecuencia la pérdida de la actividad biológica. Este método es utilizado para demostrar la presencia de proteínas: albúminas, globulinas, glutelinas y prolaminas etc. La positividad se manifiesta por la formación de un coágulo, no se conoce exactamente el mecanismo de reacción, se cree que ocurre cierta deshidratación de la molécula proteica, es por ello que la formación de este solido fácilmente observable, está asociada a la disminución de solubilidad de la proteína.

También se puede identificar proteínas mediante el uso de sustancias que al ponerse en contacto con ellas, producen una coloración específica, tal es el caso de la Reacción de Biuret.

objetivo

Comprobar la presencia de proteína en la solución proporcionada por medio de reacciones de coloración específicas para ciertos aminoácidos o grupos funcionales en las proteínas.

Procedimiento

Prueba de Biuret.

1-Tome un tubo limpio y agréguamos 2 ml de solución de albúmina.

2-Agregamos 2 ml de solución de NaOH al 10% y mezcle perfectamente (agite el tubo con cuidado).

3-Adicionamos solución de sulfato de cobre gota a gota hasta que aparezca una coloración azul violeta o púrpura.

Reacción Xantoprotéica:

1-En un tubo de ensaye coloque 2 ml de solución de albúmina.

2-Agregamos 1 ml de HNO3 concentrado.

3-Calentamos el tubo de ensaye con  mucho cuidado sobre la llama directa (observe el cambio de color y lo que sucede al precipitado).

4-Enfriamos el tubo bajo el chorro de agua y agregue lentamente y con  mucho cuidado NaOH saturado, gota a gota hasta que la coloración se torne anaranjada.

Reacción de Millón:

1-En un tubo de ensaye coloque 2 ml de solución de albúmina.

2-Adicione 3 o 4 gotas de reactivo de Millón.

3-Mezcle perfectamente y caliente con cuidado sobre la llama pequeña del mechero (el calentamiento debe hacerse hasta ebullición).

4-Observar la formación de precipitado y como ésta va cambiando de coloración con el calentamiento.

Reacción de Ninhidrina.

1-Tome con una pipeta 2 ml de solución de albúmina colóquela en un tubo de ensaye.

2-Agregue 1 ml de solución de ninhidrina y mezcle bien.

3-Coloque el tubo de ensaye en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.

4-Después de este tiempo saque el tubo y enfríe al chorro del agua.

5-Observe ahora el cambio de coloración que tiene lugar

Reacción de los aminoácidos azufrados

1-  Colocar en un tubo de ensayo de 2 a 3 ml de albúmina

2- Agregar 2 ml de solución de NaOH al 20%

3- Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5%.

4-Calentar el tubo hasta ebullición.

Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos sirve para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.

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