PRÁTICA N° 8 CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL DE ORGANELOS CELULARES:

COMPETENCIAS.-

Conoce las técnicas de homogeneización usadas en el fraccionamiento subcelular.

Comprende los fundamentos de la ténica de centrifugación usada en el fraccionamiento subcelular.

Realiza el fraccionamiento celular e identifica en este organelos de células animales.

GENERALIDADES.-

Las células eucariontes tienen organelos celulares delimitados por una sola membrana. Todos ellos pueden ser separados utilizando métodos de centrigugación diferencial y por gradientes de densidad dentro de lo que se conoce como la técnica de FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR. Dado que la mayoría de ellos tienen diferente peso molecular, viscosidad o densidad.

La técnica de Fraccionamiento Subcelular, permite obtener componentes celulares aislados,en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrolla entre otros por Alberte Cllaude y Christian Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula en base a su tamaño y densidad.

El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenización de la muestra. Esto se logra a través de diferentes procedimientos como sonicación (exposición a sonidos de alta frecuencia), shock osmótico, o simplemente moliendo las células en homogenizado res mecánicos. En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la célula, incluyendo la membrana plasmática y el retículo endoplásmico, las que queda formando pequeño fragmentos o vesículas que dan origen a la fracción microsomal. El resto de los componentes celulares (núcleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y peroximas) permanecen intactos. Las partículas y vesículas así obtenidas conservan la mayor parte de sus propiedades bioquímicas originales y permiten el estudio de la función de cada organelo celular por separado.

La suspensión de células rotas obtenidas anteriormente es llamada lisado u homogenizado, y es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso. Se realiza a través de una serie de etapas sucesivas de centrifugación en las que los componentes de las células se separan en un campo gravitacional. Si dos componentes de distinta masa e igual tamaño y forma están en un mismo medio, el cuerpo de mayor masa sedimentará (se irá al fondo) a mayor velocidad debido a su mayor peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto la fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentación también aumentará. Para aumentar el campo gravitacional se usan las centrífugas.

Estos instrumentos consisten rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor. Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor.

Figura N° 1: FASE OBTENIDAS DESPUÉS DE LA CENTRIFUGACIÓN.

Generalmente, la primera etapa de separación consiste en una centrifugación a baja velocidad a la cual sedimentan sólo las células que permanecen enteras y las partículas subcelulares más grandes, los núcleos. El sobrenadante se somete a una segunda centrifugación que se realiza a velocidades intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El nuevosobrenadante se recentrifuga a alta velocidad obteniéndose un pellet enriquecido en membrana plasmática y retículo endoplásmico (fracción microsomal). Una ultima centrifugación del sobrenadante anterior a velocidades aun mayores permite sedimentar finalmente los ribosomas, dejando en el sobrenadante solo la porción soluble del citoplasma, el citosol.

Figura N° 2: FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR TÍPICO A TRAVÉZ DE LA CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL.

Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas, pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de centrifugación en las que se utilizan medios de mayor densidad, que se obtienen con soluciones de sacarosa, polímeros o proteína. Permiten realizar el proceso de separación en gradientes de densidad, obteniendo organelos con mayores grados de pureza. Generalmente el

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