Practica 1

1. Preparaciones húmedas

1. Con una pipeta Pasteur colocar una gota de la muestra (agua de charco) en el centro del portaobjetos, cubrir la gota con un cubreobjetos.

2. Observar al microscopio con los objetivos de 10X y 40X (nunca con el objetivo de inmersión.

3. Esquematizar la morfología y movimiento de los microorganismos observados.

2. Preparaciones fijas

1. Etiquetar los portaobjetos en uno de sus extremos.

2. Colocar una pequeña gota en el centro del portaobjetos.

3. Esterilizar el asa de siembra y en condiciones asépticas tomar una pequeña cantidad del cultivo en medio sólido.

4. Con el asa mezclar suavemente el cultivo con el agua hasta obtener una suspensión homogénea y extenderla en el centro del portaobjetos.

5. Esterilizar el asa.

6. Si la muestra se toma de un cultivo líquido no es necesario poner la gota de agua, sino que se extiende directamente sobre el portaobjetos.

7. Dejar secar totalmente la preparación a temperatura ambiente.

8. Fijar el frotis con calor. Cuando el frotis está perfectamente seco pasar de cuatro a cinco veces el portaobjetos por la flama del mechero y dejar enfriar. (No calentar demasiado, debe soportar la palma de la mano el calor del portaobjetos).

3. Tinción simple

1. Cubrir el frotis fijo con 3 gotas del colorante básico (azul de metileno, safranina o cristal violeta) y dejar actuar durante 1 minuto.

2. Escurrir el colorante y lavar la preparación con agua, para ello inclinar el portaobjetos y en la parte superior aplicar el agua de la llave a chorro medio, de manera que resbale sobre el frotis.

3. Colocar el portaobjetos inclinado sobre una toalla de papel absorbente y dejar secar

a temperatura ambiente.

4. Observar al microscopio con los objetivos de 10X, 40X y 100X (inmersión).

5. Esquematizar sus observaciones y describir las características de los microorganismos observados empleando los términos adecuados respecto a la morfología, agrupación y estructuras, ejemplo:

a) bacilos largos con extremos redondos,

b) cocos agrupados en cadenas denominadas estreptococos,

c) célula móvil de forma ovoide con estructuras internas.

4. Tinciones diferenciales

Tinción de Gram

1. Preparar los frotes bacterianos a partir de cultivos líquidos o sólidos.

2. Fijar con calor.

3. Agregar cristal violeta en cantidad suficiente para cubrir el frotis (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto.

4. Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante.

5. Agregar lugol o yodo en cantidad suficiente para cubrir el frotis (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto.

6. Lavar con agua para eliminar el exceso de mordente.

7. Decolorar con alcohol acetona hasta que el efluente salga incoloro. (10 a 15 segundos).

8. Lavar con agua para eliminar el exceso de disolvente.

9. Agregar safranina en cantidad suficiente hasta cubrir el frotis (2 ó 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto.

10. Lavar con agua para eliminar el exceso del colorante de contraste.

11. Dejar secar la preparación a temperatura ambiente.

12. Observar al microscopio con los objetivos de 10X, 40X y 100X (inmersión).

13. Esquematizar las observaciones realizadas con el objetivo de mayor aumento y describir las características de los microorganismos observados e indicar si son Gram positivos (color violeta o morado) o Gram negativos.

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