Preparación del derivado dinitrofenilado de la hemoglobina:

OBJETIVOS: identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger.

Preparación del derivado dinitrofenilado de la hemoglobina:

Disolver la proteína adicionando 2.4 mL de bicarbonato de sodio al 4.2% ….. al añadir la solución de DNFB marca la proteína que queremos identificar, el HCl 3N protona la proteína y la protege para que en DNFB no reaccione después de la hidrolisis,  utilizamos éter saturado para formar la fase etérea y acuosa, en la fase etérea se encuentran los restos que pudieras existir de DNFB y en la fase acuosa la proteína con el compuesto a identificar, al momento de que se formar las fases es necesario liberar la presión, ya que a pesar de que el éter es saturado podría proyectarse.

Agregamos HCl 6N para hidrolizar la proteína y calentamos y metemos al autoclave para así poder  separar los enlaces peptídicos, debido a que este enlace es demasiado fuerte es necesario manejar presiones y temperaturas altas.

Con ayuda de éter formamos nuevamente dos fases, la etérea y la acuosa, en esta situación desechamos la fase acuosa y recolectamos en un vaso de precipitados los residuos, calentamos el vaso de precipitados para así evaporar el éter que siga presente en la solución, esto se hizo con el propósito de concentrar el derivado dinitrofenilados de la hemoglobina.

Por ultimo para poder realizar las aplicaciones en el papel cromatográfico agregamos 5mL de acetona o alcohol.

RESULTADOS:

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ANÁLISIS DE RESULTADOS

En base a lo realizado en la práctica, la reacción de Sanger nos ayuda a identificar el grupo Alfa- amino terminal de la hemoglobina, poniendo en evidencia la coloración amarilla característica de esta prueba, esto gracias al proceso intermedio llamado dinitrofenilación, qué es la adición del grupo dinitrofenil al amino terminal de la proteína. El proceso de identificación consto de una cromatografía en papel, colocando en él, cada uno de los derivados dinitrofenilados de los aminoácidos tipo DNP-Ala, DNP-Val. DNP-Phe, DNFB, solución problema, notando una similitud entre la solución problema y la solución de valina la cual se confirmó con cálculos de Rf, dónde la valina fue el dato más cercano al del problema denotando así a este aminoácido como el que contiene el grupo alfa-terminal de la proteína de la hemoglobina, igualmente se observó la aparición de una mancha que por medio de Rf indicó la presencia DNFB que no reacciono lo cual quiere decir que los lavados no se hicieron correctamente.

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