Práctica - Hemoglobina Glicosilada

INTRODUCCIÓN:

- A través de la circulación de los glóbulos rojos, la glicohemoglobina se forma continuamente por la adición de la glucosa normal terminal “N” de la cadena Beta de la hemoglobina.

Este proceso no enzimático refleja el promedio de exposición de la glucosa a la hemoglobina, sobre un periodo extenso de tiempo. En un estudio clásico, Trivelli demostró que el nivel de la glicohemoglobina en sujetos diabéticos se elevaba de 2 a 3 veces el nivel comparado con individuos normales. Algunos investigadores han recomendado que el nivel de glicohemoglobina se ubica como indicador del cont4ol de la diabetes, puesto que niveles normales indicarían que el paciente está respondiendo al tratamiento. La glicohemoglobina ha sido definida operacionalmente como “fracción rápida” de la hemoglobina (Hb-A1a, A1b, A1c) la cual fluye primero durante la cromatografía en columna con resinas de intercambio iónico. La hemoglobina no glicosilada, la cual constituye el resto de la hemoglobina, ha sido designada HbAo. El procedimiento para la determinación de la glicohemoglobina emplea una resina de intercambio catiónico de unión para la separación de la glicohemoglobina de la hemoglobina no glucosilada.

FUNDAMENTO:

- Una preparación hemolizada de sangre completa se mezcla continuamente con una resina de intercambio iónico de débil afinidad. Durante este tiempo HbAo se une a la resina, se utiliza el filtro separador para separar la resina del líquido sobrenadante el cual contiene glicohemoglobina. El porcentaje de la glicohemoglobina determinado por la medida de la absorbancia a 415 nm, de la fracción de glicohemoglobina y la hemoglobina total, calculando el cociente de las absorbancias y comparando este cociente con el del calibrador empleado.

TÉCNICA:

MATERIAL:

• Filtros separadores

• Tubos de ensaye

Equipo:

• Micropipetas .02 y 10 ml

• Pipeteado

• Mezclador hematológico

Reactivos:

• 1 botella de lisina con 15 ml

• Calibrador

• Agua desionizada

Material Biológico:

• Sangre venosa

PROCEDIMIENTO:

A. Preparación del hemolisado:

1. Coloque 0.5 ml del reactivo lisador en los tubos etiquetados como calibrador, control, muestra1, etc.

2. Coloque 0.1 ml de muestra de sangre dentro de los tubos etiquetados apropiadamente. mezcle, hasta que la lisis sea completa

3. Dejar reposar por 3 min.

B. Preparación de la glicohemoglobina:

1. Antes de usarse, mezcle bien la resina por inversión por lo menos seis veces. Agite el frasco que contiene la resina entre cada toma de reactivo.

2. Coloque 0.1 del bemolizado del paso A que contiene la resina.

3. Coloque el filtro separador dentro del tubo aproximadamente 2cm, sobre el nivel del líquido.

4. Coloque los tubos en un mezclador automático después de 5 minutos.

5. Retirar los tubos del mezclador

6. Presione el filtro el filtro separador dentro del tuvo hasta que la resina este compacta.

7. El líquido sobrenadante puede ser vaciado a otro tubo o directamente a la cubeta para medir la absorbancia.

8. Ajuste el instrumento a cero de absorbancia a 415 nm usando agua desgonzada como blanco.

9. Lea y registre los valores de la absorbancia para el calibrador, control, muestra 1, etc,

C. Fracción de la hemoglobina total:

1. Coloque 5.0 ml de agua no ionizada en los tubos etiquetados como “calibrador control, muestra 1, etc”

2. Coloque .02 ml de hemolizado preparado en el paso A dentro de los tubos etiquetados. Mezcle.

3. Ajuste el instrumento a cero de absorbancia a 415 nm usando agua desgonzada como blanco.

4. Lea registre la absorbancia para el calibrador

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